Данас†Тренутна адреса: OX11 0DE, УК, Дајмонд билдинг, Харвел научни и иновациони парк, Диеткот, Оксфордшир, УК, Дајмонд Лајт Соурсе Ко., Лтд., Центар за електронско биолошко снимање.
Реакциони центар, комплекс за сакупљање светлости 1 (RC-LH1), је основна фотосинтетска компонента љубичастих фототрофних бактерија. Увели смо две крио-електронско-микроскопске структуре RC-LH1 комплекса из Rhodopseudomonas palustris. Структура резолуције 2,65 Å RC-LH114-W комплекса састоји се од 14 подјединица LH1 петљи које окружују RC, што је прекинуто протеином W, док је комплекс без протеина W потпуно RC састав окружен RC. Затворена LH1 петља од 16 подјединица. Поређење ових структура пружа увид у динамику хинона у RC-LH1 комплексу, укључујући претходно неодређене конформационе промене при везивању хинона на QB месту RC, као и локацију помоћних места везивања хинона, која помажу у њиховом преносу на RC. Јединствена структура W протеина спречава затварање LH1 петље, чиме се ствара канал за убрзавање размене хинон/хинолон.
Енергија коју обезбеђује фотосинтеза може да одржи скоро сав живот на Земљи и има велики потенцијал за соларну биотехнологију. Док промовишу глобалну фотосинтезу, љубичасте фототрофне бактерије такође показују различите енергетске режиме и метаболичке способности. Оне могу да избегну фотосинтезу и да расту као хетеротрофне бактерије у мраку, могу да фиксирају азот и угљен-диоксид, производе водоник и разграђују ароматична једињења (1-3). Да би се обезбедила енергија за ове процесе, светлост мора брзо и ефикасно да се претвори у хемијску енергију. Овај процес почиње када комплекс антена за хватање светлости апсорбује светлост и преноси заробљену енергију у реакциони центар (RC), чиме се започиње раздвајање наелектрисања (4-7). Основна јединица фотосинтезе код љубичастих фототрофних бактерија састоји се од RC типа 2, окруженог комплексом за сакупљање светлости 1 (LH1), формирајући језгро комплекса RC-LH1. LH1 је формиран низом закривљених αβ хетеродимера, од којих сваки везује два молекула бактеријског хлорофила (BChl)α и један или два каротеноида (8-12). Најједноставнија LH1 антена се састоји од 16 или 17 αβ хетеродимера који окружују RC (9-13) у затвореној петљи, али у другим основним комплексима, трансмембрански пептиди прекидају континуитет околног LH1, чиме се подстиче дифузија хинола/хинона између RC и цитохром bc1 комплекса (11, 13-15). Љубичаста фототрофна биљка Rhodopseudomonas (Rps.) је модел организам који може да разуме пренос енергије и електрона који подржава фотосинтезу. Прва кристална структура Rps. Модел palustris RC-LH1 комплекса је RC, окружен са 15 хетеродимерних LH1 петљи, које су прекинуте непознатим протеином названим „Протеин W“ (14). Протеин W је касније идентификован као RPA4402, што је некарактерисани протеин од 10,5 kDa са три предвиђене трансмембранске спирале (TMH) (16). Предлажемо да се ген rpa4402 који кодира протеин W преименује у pufW како би био у складу са номенклатуром која се користи за гене који кодирају RC-L, M (pufL, pufM) и LH1α, β (pufA, pufB) подјединице. Занимљиво је да је протеин-W присутан само у око 10% RC-LH1, што открива да Rps. palustris производи два различита RC-LH1 комплекса. Овде извештавамо о крио-ЕМ (cryo-EM) структурама високе резолуције два основна комплекса, једном са протеином W и 14 αβ хетеродимера, другом без протеина W и затвореном LH1 петљом од 16 хетеродимера. Наша структура представља корак напред у разумевању RC-LH1 комплекса Rps. palustris, јер смо анализирали хомогену популацију сваке варијанте и имамо довољну резолуцију да јасно доделимо сваки пептид и везане пигменте и повезане липиде и хиноне. Поређење ових структура показује да три TMH протеина-W, која до сада нису пронађена ни у једном другом RC-LH1 комплексу, генеришу хинонски канал како би убрзали размену хинона/хинолона. Идентификован је низ конзервираних места везивања липида и хинона, а открили смо и нову конформациону промену након комбинације хинона и RC, која може бити погодна за RC фотосистема II (PSII) оксигенисаних фототрофних организама. Наши налази пружају нови увид у кинетику везивања и размене хинона/хинолона у RC-LH1 језгру љубичастих фототрофних бактерија.
Да бисмо олакшали детаљно проучавање два комплекса пронађена у Rps. palustris, изоловали смо сваки RC-LH1 биохемијским методама. Комплекс са недостатком протеина W (у даљем тексту ΔpufW) је пречишћен из соја којем недостаје ген pufW (16), и може се произвести само један RC-LH1 комплекс. Комплекс који садржи протеин W производи сој. Протеин W овог соја је модификован са 10x His ознаком на свом C-терминусу, тако да се комплекс који садржи протеин W може ефикасно комбиновати са већином протеина W који му недостаје имобилизацијом метала. Комплекс је ефикасно раздвојен (16) афинитетном хроматографијом (IMAC).
Као што је приказано на слици 1, оба комплекса садрже RC са три подјединице (RC-L, RC-M и RC-H) окружене LH1 антеном. Структура од 2,80 Å комплекса коме недостаје протеин-W показује 16 αβ хетеродимера, формирајући затворену LH1 петљу која потпуно окружује RC, у даљем тексту RC-LH116 комплекс. Структура од 2,65 Å комплекса који садржи протеин-W има 14-хетеродимер LH1 прекинут протеином-W, у даљем тексту RC-LH114-W.
(А и Б) Површински приказ једињења. (Ц и Д) Везани пигменти изражени у штапићима. (Е и Ф) Комплекси посматрани са цитоплазматске површине имају пептиде и LH1 подјединице представљене цртежима и нумерисани су у смеру казаљке на сату од протеин-W јаза [у складу са Rba нумерацијом. sphaeroides комплекс (13)]. За LH1-α, боја протеинске подјединице је жута; за LH1-β, боја протеинске подјединице је плава; за протеин-W, протеин је црвен; за RC-H, он је цијан; за RC-L, он је наранџаста; за RC-M, магента. Кофактори су представљени штапићима, зелена представља молекуле BChl и BPh a, љубичаста представља каротеноиде, а жута представља молекуле UQ10. (Г и Х) Увећани приказ протеин-W јаза у еквивалентном региону RC-LH114-W комплекса (Г) и RC-LH116 комплекса (Х). Кофактори су приказани у облику попуњавања простора, хелатирани хинон је приказан плавом бојом. Празина протеин-W је истакнута плавом испрекиданом линијом у (G), а мале рупе где хинон/хинолол дифундује на LH116 прстену су истакнуте црном испрекиданом линијом у (H).
Слика 1 (А и Б) приказује RC окружен отвореним или затвореним низовима LH1αβ хетеродимера, од којих сваки везује два BChl и један каротеноид (Слика 1, Ц и Д). Претходне студије су показале да је Rps LH1 комплекс. У биосинтетском путу спирулина ксантина, ове врсте садрже мешовите популације каротеноида (17). Међутим, спиропироксантин је доминантни каротеноид и његова густина је задовољавајућа. Стога смо одлучили да моделирамо спироксантин на свим местима везивања LH1. Алфа и бета полипептиди су појединачни TMH са кратким спољним регионима мембране (Слика 1, А, Б, Е и Ф). Иако густина 17 остатака на C-терминусу није примећена, алфа полипептид је одцепљен од Met1 до Ala46 у оба комплекса. β полипептид је редукован од Gly4 до Tyr52 у RC-LH116, и од Ser5 до Tyr52 у RC-LH114-W. Није примећена густина од 3 или 4 N-терминална или 13 C-терминалних остатака (слика S1). Анализа масене спектрометрије мешовитог RC-LH1 комплекса припремљеног из соја дивљег типа показала је да је недостајући регион резултат хетерологног цепања ових пептида (слика S1 и S2). Такође је примећена N-терминална формилација α-Met1 (f). Анализа је показала да се α-пептид састоји од остатака fMet1 до Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, а β-пептид се састоји од остатака Ser2 до Ala53, што је у доброј сагласности са мапом густине ЕМ на ниским температурама.
Координација α-His29 и β-His36 чини да су BChls окренути лицем у лице; сваки αβ хетеродимер се склапа са својим суседима и формира отворену петљу (RC-LH114-W) или затворену петљу (RC-LH116) око RC екситонски спрегнутог пигментног низа (слика 1, C и D). У поређењу са опсегом од 877 nm RC-LH114-W, апсорпциони црвени помак RC-LH116 на 880 nm је 3 nm (слика 2A). Међутим, спектар кружног дихроизма је скоро исти (слика 2B), што указује да иако постоји јасна разлика између отворених и затворених петљи, локално окружење BChls је веома слично. Апсорпциони црвени помак може бити резултат смањеног термичког кретања и повећане стабилности на затвореној петљи (18, 19), промене у спрезању пигмената изазване затвореном петљом (20, 21) или комбинације ова два ефекта (11).
(А) Ултраљубичасти/видљиви/блиски инфрацрвени апсорпциони спектар, чији су врхови означени одговарајућим пигментима и нормализовани на БПх врх на 775 нм. (Б) Спектар кружног дихроизма нормализован на апсорбанцију БЦхл на 805 нм. (Ц и Д) Одабрани ΔА спектри из временски разрешених апсорпционих спектара RC-LH114-W комплекса (Ц) и RC-LH116 комплекса (Д). Ради боље упоредивости, сви спектри су нормализовани на ∆А од −А на 0,2 пс. (Е) Брзина оксидације цитохрома ц2 након зрачења у присуству различитих концентрација UQ2 (видети слику С8 за сирове податке). (Ф) У ћелијама узгајаним под светлошћу ниског, средњег или високог интензитета (10, 30 или 300μMm-2 s-1, респективно), протеинске W и RC-L подјединице у пречишћеном комплексу и однос одвојених мембрана. Одредити ниво протеина помоћу SDS-полиакриламидне гел електрофорезе и имунолошког теста (видети слику S9 за сирове податке). Одредити однос у односу на пречишћени RC-LH114-W комплекс. Стехиометријски однос RC-L према протеину-W комплекса је 1:1.
БЦхл на позицији 1 у деформисаној αβ14 петљи RC-LH114-W (слика 1, А, Ц и Е) су ближи примарном донору RC (P) за 6,8 Å него еквивалентни БЦхл у RC-LH116 (слика 1, Б, Д и Ф, и слика S3); међутим, кинетика пролазне апсорпције два комплекса показује да су за RC-LH114-W и RC-LH116 временске константе преноса енергије побуђивања од LH1 до RC 40 ± 4 и 44 ± 3 пс (слика 2). , Ц и Д, слика S4 и табела S2). Такође нема значајне разлике у електронском преносу унутар RC (слика S5 и повезани додатни текст). Сумњамо да је блиска подударност времена преноса енергије између LH1 и RC-P последица сличне удаљености, угла и потенцијалне енергије већине БЦхл у две LH1 петље. Изгледа да истраживање енергетског обрасца LH1 ради достизања минималне удаљености није брже од директног преноса енергије са субоптималних места на RC. Отворена петља LH1 у RC-LH114-W такође може бити подложна незнатном термичком кретању под условима ниске температуре за структурну анализу, а постоји дужа конформација прстена αβ14 на собној температури од пигментационе удаљености βBChls на позицији RC1.
Комплекс RC-LH116 садржи 32 BChl-а и 16 каротеноида, а његов укупни распоред је исти као онај добијен из Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Банка података о протеинима (PDB) ID 5Y5S] (9), соја Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) и зелених алги (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Након поравнања, примећена су само мала одступања у положајима αβ хетеродимера, посебно 1-5, 15 и 16 (Слика S6). Присуство протеина-W има значајан утицај на структуру LH1. Његова три TMH су повезана кратким петљама, са N-терминалом на луменској страни комплекса и C-терминалом на цитоплазматској страни (Слике 1A и 3, од A до D). Протеин-W је углавном хидрофобан (слика 3Б), а TMH2 и TMH3 интерагују са LH1αβ-14 формирајући трансмембранску површину (слика 3, Б и Е до Г). Интерфејс је углавном састављен од остатака Phe, Leu и Val у трансмембранском региону. Ови остаци су наслагани са хидрофобним аминокиселинама и αβ-14 пигментима. Неки поларни остаци такође доприносе интеракцији, укључујући водоничну везу између W-Thr68 и β-Trp42 на површини комплексне шупљине (слика 3, Ф и Г). На површини цитоплазме, Gln34 је поред кето групе αβ-14 каротеноида. Поред тога, молекул n-додецил β-д-малтозида (β-DDM) је раздвојен, а његов хидрофобни реп се продужио до интерфејса између протеина-W и αβ-14, а липидни реп се може налазити у телу. Такође смо приметили да су C-терминални региони резолуције протеина W и RCH веома близу, али не у оквиру формирања специфичних интеракција (Слика 1, А и Е). Међутим, могуће је да постоје интеракције у нераздвојеним C-терминалним аминокиселинама ова два протеина, што може пружити механизам за регрутовање протеина-W током склапања RC-LH114-W комплекса.
(А) Протеин-W, који је окренут ка интерфејсу са LH1αβ14 у цртаном облику, има бочни ланац у облику штапића (црвени), приказан у делу дијаграма електростатичког потенцијала (провидна сива површина са нивоом контуре од 0,13). (Б) Протеин-W представљен хидрофобно обојеном површином. Поларне и наелектрисане области су приказане цијан бојом, хидрофобне области су приказане белом бојом, а јако хидрофобне области су приказане наранџастом бојом. (Ц и Д) Протеин-W представљен цртаним цртежом, његова оријентација је иста као у (А) (Ц), и ротиран је за 180° (Д). Према положају у секвенци, препознатљиви остаци усвајају шему дугиних боја, где је N-терминал плав, а C-терминал црвен. (Е) Протеин-W у истом приказу као у (А), а остаци на интерфејсу протеин-W:LH1 су представљени штапићима са причвршћеним ознакама. (Ф) Протеин-W је ротиран за 90° у односу на (Е) и LH1αβ14 у цртаном приказу, и у односу на остатке на интерфејсу у тракастом приказу. Висећи остаци бета полипептида су обележени. Кофактор је приказан као трака која одговара боји слике 1, разложени β-DDM је приказан сивом бојом, а кисеоник је приказан црвеном бојом. (G) Приказ на (F) је ротиран за 180°, са истакнутим остацима обележеног алфа полипептида.
Протеин-W замењује αβ хетеродимер (15. на слици 1F), чиме спречава затварање петље и нагињање прва три αβ хетеродимера. Примећено је да је максимални угао нагиба првог αβ-1 хетеродимера у односу на нормалу филма био 25° до 29° (слика 1, А и Е), што је формирано нагибом αβ-1 од 2° до 8° у RC A оштро контраст-LH116 (слика 1, Б и Ф). Други и трећи хетеродимер су нагнути под углом од 12° до 22° и 5° до 10°, респективно. Због стеричких сметњи RC, нагиб αβ-1 не укључује други пар αβ (што одговара 16. αβ на слици 1F), чиме се формира јасна празнина у LH1 прстену (слика 1, А и Е). Због недостатка два αβ хетеродимера, праћеног губитком четири BChl и два каротеноида, ниједан од каротеноида се не везује за увијену αβ-1 подјединицу, што резултира LH114-W прстеном који садржи 13 вегетаријанских каротеноида и 28 BChl. Процене локалне резолуције два комплекса у αβ1 до 7 регионима су ниже од оних за остатак LH1 петље, што може одражавати инхерентну пластичност LH1 подјединице поред RC QB места (Слика 4).
Слике RC-LH114-W (A и B) и RC-LH116 (C и D) су приказане из истог погледа одозго/бочног погледа (A и B) (A и C) и површине шупљине као на слици 1 (B и D). Обојени тастери су приказани са десне стране.
Једини други карактеристични основни комплекс са стехиометријским односом од 1:14 је димер Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Међутим, протеин W и PufX немају очигледну хомологију и имају значајан утицај на своје одговарајуће LH1 структуре. PufX је један TMH са N-терминалним цитоплазматским доменом који интерагује са цитоплазматском страном RC-H подјединице (13) на позицији која одговара Rps. palustris LH116αβ-16. PufX ствара канал за размену хинона/хинолона између RC-LH1 и цитохром bcl комплекса и присутан је у свим основним комплексима Rba. sphaeroides (13). Иако је интерфејс мономер-мономер у Rba. Димер sphaeroides RC-LH1-PufX налази се на позицији везивања протеина W у RC-LH114-W, а празнина индукована PufX и протеином-W је на еквивалентној позицији (слика S7A). Празина у RC-LH114-W је такође поравната са хипотетичким хинонским каналом (8) Pseudomonas rosea LH1, који је формиран од пептида који нису повезани са протеином W или PufX (слика S7B). Поред тога, хинонски канал у Blc. Смарагдно зелени LH1 формиран искључивањем једне γ подјединице (7) налази се на сличној позицији (слика S7C). Иако је посредован различитим протеинима, појава ових хинонских/хинололних канала на заједничкој позицији у RC-LH1 комплексу изгледа као пример конвергентне еволуције, што указује да празнина коју ствара протеин W може деловати као хинонски канал.
Размак у петљи LH114-W омогућава формирање континуираног мембранског региона између унутрашњег простора комплекса RC-LH114-W и главне мембране (слика 1G), уместо повезивања два домена кроз протеинску пору као код протеина. Комплекс RC-LH116 је сличан затвореном Tch. комплексу налик игли (22) (слика 1H). Пошто је дифузија хинона кроз мембрану бржа од дифузије кроз уски протеински канал, отворена петља LH114-W може омогућити бржи промет RC него затворена петља LH116, а дифузија хинона у RC може бити ограниченија. Да бисмо тестирали да ли протеин W утиче на конверзију хинона кроз RC, извршили смо тест оксидације цитохрома на одређеној концентрацији убихинона 2 (UQ2) (аналог природног UQ10 са краћим изопренским репом) (слика 2E). Иако присуство хелираног хинона отежава тачно одређивање привидне Михаелисове константе (RC-LH114-W и RC-LH116 су погодни за 0,2±0,1μM и 0,5±0,2μM, респективно), максимална брзина RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) је 28±5% већа од RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
У почетку смо проценили да је протеин-W присутан у око 10% основног комплекса (16); овде су стопе попуњености ћелија раста при слабом, средњем и јаком светлу 15±0,6%, 11±1% и 0,9±0,5%, респективно % (Слика 2F). Квантитативно поређење масене спектрометрије показало је да додавање хистидинске ознаке није смањило релативну количину протеина-W у поређењу са сојевима дивљег типа (P = 0,59), тако да ови нивои нису артефакт модификованог протеина-W (Слика S10). Међутим, ова ниска попуњеност протеина-W у RC-LH1 комплексу може омогућити неким RC-има да се убрзано пребацују, чиме се ублажава спорија размена хинона/хинолона у RC-LH116 комплексу. Приметили смо да је стопа попуњености при високом светлу нескладна са недавним транскриптомским подацима, што указује да се експресија гена pufW повећава под јаким светлом (Слика S11) (23). Разлика између транскрипције pufW и уградње протеина-W у RC-LH1 комплекс је збуњујућа и може одражавати сложену регулацију протеина.
У RC-LH114-W, 6 кардиолипинских (CDL), 7 фосфатидилхолинских (POPC), 1 фосфатидилглицерол (POPG) и 29 β-DDM молекула су алоцирани и моделирани у њему 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG и 12 βDDM. RC-LH116 (Слика 5, А и Б). У ове две структуре, CDL се скоро налази на цитоплазматској страни комплекса, док се POPC, POPG и β-DDM углавном налазе на луминалној страни. Два молекула липида и детерџента су изолована у αβ-1 до αβ-6 региону RC-LH114-W комплекса (Слика 5А), а пет је изоловано у еквивалентном региону RC-LH116 (Слика 5Б). Више липида је пронађено на другој страни комплекса, углавном CDL, акумулираних између RC и αβ-7 до αβ-13 (Слика 5, А и Б). Други структурно раздвојени липиди и детерџенти налазе се изван LH1 прстена, а добро раздвојени ацилни ланци се протежу између LH1 подјединица, оквирно означених као β-DDM у RC-LH114-W, и дефинисаних као β-DDM у RC A смеши β-DDM и POPC-LH116. Слични положаји хелатних липида и детерџената у нашој структури указују на то да су они физиолошки релевантна места везивања (слика S12A). Положаји еквивалентних молекула у Tch такође имају добру конзистентност. Нежни и Trv. Сој 970 RC-LH1s (слика S12, B до E) (9, 12) и остаци водоничних веза липидне главе показали су прилично добру конзервацију у поравнању секвенце (слика S13), што указује да конзервирани CDL који се везује за RC (24), ова места могу бити конзервисана у RC-LH1 комплексу.
(А и Б) RC-LH114-W (А) и RC-LH116 (Б) пептиди су представљени цртаним линијама, а пигменти су представљени штапићима, користећи шему боја на слици 1. Липиди су приказани црвеном бојом, а детерџенти сивом. UQ везан за RC QA и QB места је жутог карактера, док је изоловани UQ плавог карактера. (Ц и Д) Исти прикази као (А) и (Б), са изостављеним липидима. (Е до Г) Увећани приказ Q1(Е), Q2(Ф) и Q3(Г) из RC-LH116, са бочним ланцима који утичу један на други. Водоничне везе су приказане као црне испрекидане линије.
У RC-LH116, и RC QA и QB UQ, који учествују у преносу електрона у процесу раздвајања наелектрисања, разложени су на својим местима везивања. Међутим, у RC-LH114-W, QB хинон није раздвојен и биће детаљно размотрен у наставку. Поред QA и QB хинона, два хелатна UQ молекула (лоцирана између RC и LH1 прстенова) су распоређена у структури RC-LH114-W према њиховим добро раздвојеним главним групама (лоцираним у Q1 и Q2, респективно). Слика 5C). Две изопренске јединице су додељене Q1, а мапа густине раздваја комплетних 10 изопренских репова Q2. У структури RC-LH116, раздвојена су три хелатна UQ10 молекула (Q1 до Q3, слика 5D), и сви молекули имају јасну густину кроз цео реп (слика 5, D до G). У ове две структуре, положаји хинонских главних група Q1 и Q2 имају одличну конзистентност (слика S12F) и интерагују само са RC. Q1 се налази на улазу у W јаз RC-LH114-W (слика 1G и 5, C, D и E), а Q2 се налази близу места везивања QB (слика 5, C, D) и F). Конзервирани остаци L-Trp143 и L-Trp269 су веома близу Q1 и Q2 и пружају потенцијалне π-стакинг интеракције (слика 5, E и F, и слика S12). L-Gln88, 3,0 Å од дисталног кисеоника Q1, пружа јаку водоничну везу (слика 5E); овај остатак је конзервиран у свим RC осим у најудаљенијем односу (слика S13). L-Ser91 је конзервативно супституисан за Thr у већини других RC (слика S13), удаљен је 3,8 Å од метил кисеоника Q1 и може да обезбеди слабе водоничне везе (слика 5E). Q3 изгледа нема специфичну интеракцију, али се налази у хидрофобном региону између RC-M подјединице и LH1-α подјединице 5 до 6 (слика 5, D и G). Q1, Q2 и Q3 или оближњи хелатирани хинони су такође раздвојени у Tch. Gentle, Trv. Strain 970 и Blc. Структура ириса (9, 10, 12) указује на конзервирано помоћно место везивања хинона у RC-LH1 комплексу (слика S12G). Пет разложених UQ у RC-LH116 су у доброј сагласности са 5,8±0,7 сваког комплекса одређених високоефикасном течном хроматографијом (HPLC), док су три разложена UQ у RC-LH114-W нижа од Измерена вредност од 6,2±0,3 (Сл. S14) указује да у структури постоје неразложени UQ молекули.
Псеудосиметрични L и M полипептиди садрже по пет TMH и формирају хетеродимер који комбинује један BChl димер, два BChl мономера, два бактериофага (BPh) мономера и један нехемски молекул гвожђа и један или два UQ10 молекула. ​​Због присуства водоничних веза на терминалној кетонској групи и његове познате акумулације у Rps, каротеноиди су уграђени у M-подјединицу, која се назива цис-3,4-дехидроорходопин. Врсте (25). Спољни мембрански домен RC-H је усидрен за мембрану помоћу једног TMH. Укупна RC структура је слична тројединичној RC сродних врста (као што је Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Макроциклуси BChl и BPh, каротеноидни ланац и нехемско гвожђе се преклапају унутар опсега резолуције ових структура, као и UQ10 главна група на QA месту и QB хинон на RC-LH116 (слика S15).
Доступност две RC структуре са различитим стопама попуњености QB места пружа нову прилику за испитивање конзистентних конформационих промена које прате везивање QB хинона. У RC-LH116 комплексу, QB хинон се налази у потпуно везаном „проксималном“ положају (26), али раздвајање RC-LH114-W нема QB хинона. У RC-LH114-W нема QB хинона, што је изненађујуће јер је комплекс активан, више него RC-LH116 комплекс са структурно раздвојеним QB хиноном. Иако два LH1 прстена хелирају око шест хинона, пет је структурно раздвојено у затвореном RC-LH116 прстену, док су само три структурно ограничена у отвореном RC-LH114-W прстену. Овај повећани структурни поремећај може одражавати бржу замену QB места RC-LH114-W, бржу кинетику хинона у комплексу и повећану вероватноћу преласка LH1 петље. Претпостављамо да недостатак UQ-а на RC QB месту RC-LH114-W може бити резултат сложенијег и активнијег комплекса, а QB место RC-LH114-W је одмах замрзнуто у UQ обрту. Специфична фаза (улаз на QB место је затворен) одражава конформацију ове активности.
Без QB, пратећа ротација L-Phe217 у положај који је некомпатибилан са везивањем UQ10, јер ће изазвати просторни судар са првом изопренском јединицом репа (Слика 6А). Поред тога, очигледне главне конформационе промене су очигледне, посебно хеликс de (кратки хеликс у петљи између TMH D и E) где је L-Phe217 померен у џеп за везивање QB и ротација L-Tyr223 (Слика 6А) да би се прекинула водонична веза са M-Asp45 оквиром и затворио улаз места за везивање QB (Слика 6Б). Хеликс de се окреће у својој бази, Cα L-Ser209 је померен за 0,33 Å, док је L-Val221Cα померен за 3,52 Å. Нема видљивих промена у TMH D и E, које се могу преклопити у обе структуре (Слика 6А). Колико знамо, ово је прва структура у природном RC која затвара QB место. Поређење са комплетном (QB-везаном) структуром показује да је пре редуковања хинона потребна конформациона промена да би ушао у хинон. L-Phe217 се ротира да би формирао π-интеракцију слагања са главном групом хинона, а хеликс се помера ка споља, омогућавајући скелету L-Gly222 и бочном ланцу L-Tyr223 да формирају мрежу водоничних веза са стабилном структуром водоничних веза (слика 6, А и Ц).
(А) Преклапајући цртеж холограмске (Л ланац, наранџаста/М ланац, магента) и апо (сиве) структуре, у којој су кључни остаци приказани у облику штапићастог приказа. UQ10 је представљен жутом траком. Испрекидана линија означава водоничне везе формиране у целој структури. (Б и Ц) Површински приказ аполипопротеина и целе прстенасте структуре, са истакнутим кисеоником бочног ланца L-Phe217 плавом и L-Tyr223 црвеном бојом, респективно. L подјединица је наранџаста; M и H подјединице нису обојене. (Д и Е) Аполипопротеин (Д) и цела (Е) RC QB места [обојено према (А) респективно] и Thermophilus thermophilus PSII (зелена, плава са пластичним хиноном; PDB ID: 3WU2) Поравнање (58).
Неочекивано, иако је доступно неколико структура RC-ова са недостатком QB-а, а без LH1, конформационе промене примећене у овој студији нису раније објављене. То укључује структуру осиромашења QB-а из Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) и Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), које су све готово исте као и њихова укупна QB структура. Пажљивим испитивањем 3PRC откривено је да се молекули детерџента LDAO (лаурил диметил амин оксид) везују на улазу у QB позицију, што може спречити преуређење у затворену конформацију. Иако се LDAO не разлаже на истој позицији у 1EYS или 1OGV, ови RC-ови се припремају коришћењем истог детерџента и стога могу произвести исти ефекат. Кристална структура Rba. Сфероидни РЦ кокристализовани са цитохромом ц2 (ПДБ ИД: 1Л9Б) такође изгледа имају затворено QB место. Међутим, у овом случају, Н-терминални регион РЦ-М полипептида (који интерагује са QB местом везивања преко Х везе Tyr остатка на Q хеликсу) усваја неприродну конформацију, а QB конформациона промена није даље истражена (30). Охрабрујуће је да нисмо видели ову врсту деформације М полипептида у структури РЦ-ЛХ114-В, која је скоро иста као Н-терминални регион РЦ-ЛХ116. Такође треба напоменути да су након уклањања LH1 антене на бази детерџента, аполипопротеински РЦ у ПДБ-у разрешени, што је елиминисало унутрашње хинонске базене и липиде у простору између РЦ и унутрашње површине околног LH1 прстена (31, 32). RC остаје функционалан јер задржава све кофакторе, осим разградивог QB хинона, који је мање стабилан и често се губи током процеса припреме (33). Поред тога, познато је да уклањање LH1 и природних цикличних липида из RC може имати утицај на функције, као што је скраћени век трајања P+QB стања са раздвојеним наелектрисањем (31, 34, 35). Стога, претпостављамо да постојање локалног LH1 прстена који окружује RC може одржати „затворено“ QB место, тиме очувајући локално окружење у близини QB.
Иако аполипопротеин (без QB хинона) и комплетна структура представљају само два снимка обрта QB места, а не низ догађаја, постоје индикације да везивање може бити ограничено како би се спречило поновно везивање хидрохиноном ради инхибиције инхибиције супстрата. Интеракција хинолола и хинона у близини QB места аполипопротеина може бити различита, што доводи до његовог одбацивања од стране RC. Одавно је предложено да конформационе промене играју улогу у везивању и редукцији хинона. Способност замрзнутих RC да редукују хиноне након адаптације на мрак је ослабљена (36); рендгенска кристалографија показује да је ово оштећење последица QB хинона који су заробљени у „дисталној“ конформацији око 4,5 Å од активне проксималне позиције (26, 37). Сугеришемо да је ова дистална конформација везивања снимак средњег стања између аполипопротеина и пуне прстенасте структуре, које следи након почетне интеракције са хиноном и отварања QB места.
Тип II RC који се налази у PSII комплексу одређених фототрофних бактерија и цијанобактерија, алги и биљака има структурну и функционалну конзервацију (38). Структурно поравнање приказано на слици 6 (D и E) наглашава сличност између PSII RC и QB места бактеријског RC комплекса. Ово поређење је дуго било модел за проучавање уско повезаних система везивања и редукције хинона. Претходне публикације сугерисале су да су конформационе промене праћене PSII редукцијом хинона (39, 40). Стога, узимајући у обзир еволутивну конзервацију RC, овај раније непримећени механизам везивања може бити применљив и на QB место PSII RC у оксигенисаним фототрофним биљкама.
Сојеви Rps ΔpufW (необележена pufW делеција) и PufW-His (C-терминални 10x His-обележени протеин-W експресован из природног pufW локуса). palustris CGA009 је описан у нашем претходном раду (16). Ови сојеви и изогени родитељ дивљег типа су изоловани из замрзивача наношењем малог броја ћелија на PYE (свака од 5 g литар -1) (чувана у LB на -80 °C, која садржи 50% (w/v) глицерол) протеина, екстракта квасца и сукцината) агар [1,5% (w/v)] плочу. Плоча је инкубирана преко ноћи у мраку на собној температури под анаеробним условима, а затим осветљена белим светлом (~50 μmolm-2 s-1) које су обезбеђивале OSRAM 116-W халогене сијалице (RS Components, Велика Британија) током 3 до 5 дана док се није појавила једна колонија. Једна колонија је коришћена за инокулацију 10 мл М22+ медијума (41) допуњеног са 0,1% (w/v) казамино киселина (у даљем тексту М22). Култура је гајена у условима са ниским садржајем кисеоника у мраку на 34°C уз мућкање брзином од 180 о/мин током 48 сати, а затим је 70 мл културе инокулирано под истим условима током 24 сата. Полуаеробна култура запремине 1 мл је коришћена за инокулацију 30 мл М22 медијума у ​​универзалној провидној стакленој бочици са затварачем на завртање од 30 мл и озрачена уз мућкање (~50μmolm-2 s-1) током 48 сати помоћу стерилне магнетне мешалице. Затим је 30 мл културе инокулирано са око 1 литром културе под истим условима, која је затим коришћена за инокулацију око 9 литара културе осветљене брзином од ~200 μmolm-2 s-1 током 72 сата. Ћелије су сакупљене центрифугирањем на 7132 RCF током 30 минута, ресуспендоване у ~10 мл 20 mM трис-HCl (pH 8,0) и чуване на -20°C до потребе.
Након одмрзавања, додајте неколико кристала дезоксирибонуклеазе I (Merck, Велика Британија), лизозима (Merck, Велика Британија) и две таблете Roche холоензим протеазног инхибитора (Merck, Велика Британија) у ресуспендоване ћелије. У француској ћелији под притиском од 20.000 psi (Aminco, САД), ћелије су разбијене 8 до 12 пута. Након уклањања неразбијених ћелија и нерастворљивих остатака центрифугирањем на 18.500 RCF током 15 минута на 4°C, мембрана је исталожена из пигментираног лизата центрифугирањем на 113.000 RCF током 2 сата на 43.000°C. Одбаците растворљиву фракцију и ресуспендујте обојену мембрану у 100 до 200 мл 20 mM трис-HCl (pH 8,0) и хомогенизујте док не буду нестали видљиви агрегати. Суспендована мембрана је инкубирана у 20 mM трис-HCl (pH 8,0) (Anatrace, САД) који садржи 2% (w/v) β-DDM током 1 сата у мраку на 4°C уз благо мешање. Затим је центрифугирана на 70°C да би се растворило 150.000 RCF на 4°C током 1 сата ради уклањања преосталих нерастворљивих материја.
Солубилизирајућа мембрана из соја ΔpufW је нанета на 50 мл DEAE Sepharose јонско-измењивачку колону са три запремине колоне (CV) везивног пуфера [20 mM tris-HCl (pH 8,0) који садржи 0,03% (w/v) β-DDM]. Испрати колону са два CV везивна пуфера, а затим испрати колону са два везивна пуфера која садрже 50 mM NaCl. RC-LH116 комплекс је елуиран линеарним градијентом од 150 до 300 mM NaCl (у везивном пуферу) на 1,75 CV, а преостали везивни комплекс је елуиран везивним пуфером који садржи 300 mM NaCl на 0,5 CV. Сакупити апсорпциони спектар између 250 и 1000 nm, одржавати фракцију са односом апсорбанције (A880/A280) већим од 1 на 880 до 280 nm, разблажити је два пута у везивном пуферу и поново користити исти поступак на DEAE колони приликом пречишћавања. Разблажити фракције са односима А880/А280 већим од 1,7 и односима А880/А805 већим од 3,0, извршити трећи круг јонске измене и задржати фракције са односима А880/А280 већим од 2,2 и односима А880/А805 већим од 5,0. Делимично пречишћени комплекс је концентрован на ~2 мл у центрифугалном филтеру са граничном вредношћу молекулске тежине Amicon 100.000 (MWCO) (Merck, УК), и стављен на колону за искључивање по величини Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, САД) која садржи 200 mM NaCl пуфер, а затим елуиран у истом пуферу при 1,5 CV. Сакупите апсорпционе спектре фракције искључивања величине и концентришите апсорпционе спектре са односима А880/А280 преко 2,4 и односима А880/А805 преко 5,8 до 100 А880, и одмах их користите за припрему или складиштење крио-ТЕМ мреже. Чувати на -80°C док не буду потребни.
Солубилизирајућа мембрана из соја PufW-His је нанета на колону HisPrep FF Ni-NTA Sepharose од 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) која садржи 200 mM NaCl и 0,03% (w/w)) у IMAC пуферу (GE Healthcare). v) β-DDM]. Колона је испрана са пет CV IMAC пуфера, а затим са пет CV IMAC пуфера који садржи 10 mM хистидина. Језгро комплекса је елуирано из колоне са пет IMAC пуфера који садрже 100 mM хистидина. Фракција која садржи RC-LH114-W комплекс је концентрована на ~10 ml у резервоару за мешање опремљеном Amicon 100,000 MWCO филтером (Merck, Велика Британија), разблажена 20 пута пуфером за везивање, а затим додата у 25 ml. У DEAE Sepharose колони, четири CV везана за пуфер су унапред коришћена. Испрати колону са четири CV пуфера за везивање, затим елуирати комплекс на осам CV на линеарном градијенту од 0 до 100 mM NaCl (у пуферу за везивање), а преостала четири CV садрже 100 mM пуфер за везивање. Преостали комплекси елуирани на натријум хлориду у комбинацији са односом А880/А280 већим од 2,4 и односом А880/А805 већим од 4,6 фракција су концентроване на ~2 мл у центрифугалном филтеру Amicon 100.000 MWCO и напуњене са 1,5 CV IMAC унапред пуферски уравнотежене колоне за искључивање по величини Superdex 200 16/600, а затим елуиране у истом пуферу преко 1,5 CV. Сакупити апсорпционе спектре фракција искључивања величине и концентровати апсорпционе спектре са односима А880/А280 преко 2,1 и односима А880/А805 преко 4,6 до 100 А880, који се одмах користе за припрему замрзнуте ТЕМ мреже или чувају на -80°C до потребе.
За припрему TEM мрежа на ниским температурама коришћен је Leica EM GP замрзивач за имерзију. Комплекс је разблажен у IMAC пуферу до A880 од 50, а затим је 5 μl нането на новоиспуњену QUANTIFOIL 1.2/1.3 бакарну мрежу обложену угљеником (Agar Scientific, УК). Инкубирати мрежу на 20°C и 60% релативне влажности током 30 секунди, затим је осушити упијањем током 3 секунде, а затим је угасити у течном етану на -176°C.
Подаци RC-LH114-W комплекса су снимљени на eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) помоћу Titan Krios микроскопа, који ради на напону убрзавања од 300kV, са номиналним увећањем од 130.000× и енергијом од - Изаберите размак од 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum са K2 детектором пикова је коришћен за снимање слика у режиму бројања ради прикупљања података. Калибрисана величина пиксела је 1,048 Å, а брзина дозе је 3,83 e-Å-2s-1. Филм је сакупљен за 11 секунди и подељен на 40 делова. Користи се подручје обложено угљеником за рефокусирање микроскопа, а затим су сакупљена три филма по рупи. Укупно је сакупљено 3130 филмова, са вредностима дефокусирања између -1 и -3μm.
Подаци за RC-LH116 комплекс прикупљени су коришћењем истог микроскопа у Лабораторији за биоструктуру Астербери (Универзитет у Лидсу, Велика Британија). Подаци су прикупљени у режиму бројања са увећањем од 130 k, а величина пиксела је калибрирана на 1,065 Å са дозом од 4,6 e-Å-2s-1. Филм је снимљен за 12 секунди и подељен на 48 делова. Укупно је прикупљено 3359 филмова, са вредностима дефокусирања између -1 и -3μm.
Сва обрада података се врши у Relion 3.0 цевоводу (42). Користите Motioncorr 2 (43) да бисте кориговали кретање снопа дозним пондерисањем, а затим користите CTFFIND 4.1 (44) да бисте одредили параметар CTF (функција преноса контраста). Типичне фотомикрографије након ових почетних фаза обраде приказане су на слици 2. S16. Шаблон за аутоматску селекцију генерише се ручним одабиром око 250 пиксела од 1000 честица у оквиру од 250 пиксела и без референтне дводимензионалне (2D) класификације, чиме се одбацују оне класификације које одговарају контаминацији узорка или немају препознатљиве карактеристике. Затим је извршена аутоматска селекција на свим микрофотографијама, а RC-LH114-W је имао 849.359 честица, а RC-LH116 комплекс 476.547 честица. Све одабране честице су прошле два круга нереферентне 2Д класификације, и након сваког покушаја, честице које испуњавају услове угљеничне области, контаминације узорка, без очигледних карактеристика или честица које се јако преклапају се одбацују, што је резултирало са 772.033 (90,9%) и 359.678 (75,5%) честица. Почетни 3Д референтни модел је генерисан коришћењем методе стохастичког градијентног спуштања. Користећи почетни модел као референцу, одабране честице су класификоване у четири категорије у 3Д. Користећи модел у овој категорији као референцу, извршите 3Д рафинирање честица у највећој категорији, затим користите почетни нископропусни филтер од 15 Å да бисте покрили област растварача, додајте 6 пиксела меких ивица и накнадно обрадите пикселе да бисте исправили Гатан К2 пикову модулациону преносну функцију горњег детектора. За скуп података RC-LH114-W, овај почетни модел је модификован уклањањем јаке густине на ивицама маске (одвојене од густине основног комплекса у UCSF Chimera). Добијени модели (резолуције RC-LH114-W и RC-LH116 су 3,91 и 4,16 Å, респективно) користе се као референца за други круг 3D класификације. Коришћене честице су груписане у почетну 3D класу и не садрже јаку корелацију са суседством. Преклапање или недостатак очигледних структурних карактеристика. Након другог круга 3D класификације, изабрана је категорија са највећом резолуцијом [За RC-LH114-W, једна категорија је 377.703 честице (44,5%), за RC-LH116 постоје две категорије, укупно 260.752 честице (54,7%), где су исте само када су поравнате након почетне ротације са малом разликом]. Одабране честице се поново екстрахују у кутији од 400 пиксела и рафинишу 3Д рафинирањем. Маска растварача се генерише коришћењем почетног нископропусног филтера од 15 Å, проширења мапе од 3 пиксела и меке маске од 3 пиксела. Користећи рафинирање CTF-а по честици, корекцију кретања по честици и други круг рафинирања CTF-а по честици, 3Д рафинирање, маскирање растварача и постпроцесирање се врше након сваког корака како би се додатно рафинисала резултујућа текстура. Користећи граничну вредност FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) од 0,143, резолуције коначних модела RC-LH114-W и RC-LH116 су 2,65 и 2,80 Å, респективно. FSC крива коначног модела је приказана на слици 2. S17.
Све протеинске секвенце су преузете са UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) је коришћен за конструисање хомологног модела RC, који садржи протеинске секвенце RC-L, RC-M и RC-H и кристалну структуру Rba. sphaeroides RC је коришћен као шаблон (PDB ID: 5LSE) (46). Користите алатку „fit map“ у UCSF Chimera да бисте уклопили генерисани модел у мапу (47), побољшали структуру протеина и додали кофактор [4×BChl a (назив остатка из библиотеке мономера = BCL), 2×BPh a (BPH), једну или две врсте UQ10 (U10), једно нехемско гвожђе (Fe) и један 3,4-дихидрохексакарбонилхолин (QAK)] помоћу Coot-а (48). Пошто QAK није доступан у библиотеци мономера, параметризовао се помоћу алатке eLBOW у PHENIX-у (49).
Затим је конструисана LH1 подјединица. У почетку је алат за аутоматску конструкцију у PHENIX-у (49) коришћен за аутоматску конструкцију дела LH1 секвенце користећи мапу и LH1-α и LH1-β протеинске секвенце као улаз. Изаберите најкомплетнију LH1 подјединицу, екстрахујте је и учитајте је у Coot, ручно додајте недостајућу секвенцу у њу и ручно пречиштите целу структуру пре додавања два BCl a (BCL) и спирилоксантина (CRT) [у складу са релевантним Rps густином LH1 комплекса и познатим садржајем каротеноида. Врсте (17)]. Копирајте комплетну LH1 подјединицу и користите UCSF Chimera „Docking Map Tool“ да бисте је спојили са суседном немоделном областом густине LH1, а затим је пречиштите у Coot-у; понављајте поступак док се не моделирају све LH1 подјединице. За структуру RC-LH114-W, екстракцијом неалоциране густине у Coot-у, протеин је сегментиран од преосталих непротеинских компоненти на USCF химерној мапи и алатка Autobuild се користи за успостављање почетног модела и моделирања преосталих подјединица (протеин-W). У PHENIX-у (49). Додајте све недостајуће секвенце резултујућем моделу у Coot-у (48), а затим ручно прецизирајте целу подјединицу. Преостала неалоцирана густина одговара комбинацији липида (PDB мономерна библиотека ID CDL = CDL, POPC = 6PL и POPG = PGT), β-DDM детерџента (LMT) и UQ10 молекула (U10). Користите PHENIX оптимизацију (49) и ручну оптимизацију у Coot-у (48) да бисте усавршили комплетан почетни модел док се статистика модела и визуелни квалитет уклапања не могу даље побољшати. Коначно, користите LocScale (50) да бисте изоштрили локалну мапу, а затим извршите неколико других циклуса моделирања неалоциране густине и аутоматске и ручне оптимизације.
Одговарајући пептиди, кофактори и други липиди и хинони усидрени унутар њихових одговарајућих густина приказани су на сликама 1 и 2. S18 до S23. Статистичке информације коначног модела приказане су у табели S1.
Осим ако није другачије назначено, UV/Vis/NIR апсорпциони спектри су прикупљени на Cary60 спектрофотометру (Agilent, САД) у интервалима од 1 nm од 250 nm до 1000 nm и временом интеграције од 0,1s.
Разблажити узорак у кварцној кивети са путањом од 2 mm до A880 од 1 и сакупити апсорпциони спектар између 400 и 1000 nm. Кружни дихроични спектри су сакупљени на спектрополариметру Jasco 810 (Jasco, Јапан) у интервалима од 1 nm између 400 nm и 950 nm при брзини скенирања од 20 nm min-1.
Моларни коефицијент екстинкције одређује се разблаживањем језгра комплекса до А880 од приближно 50. Разблажити запремину од 10 μл у 990 μл пуфера за везивање или метанола и одмах сакупити апсорпциони спектар како би се минимизирала разградња BChl. Садржај BChl сваког узорка метанола израчунат је коефицијентом екстинкције на 771 nm од 54,8 mM-1 cm-1, а коефицијент екстинкције је одређен (51). Измерену концентрацију BChl поделити са 32 (RC-LH114-W) или 36 (RC-LH116) да би се одредила концентрација језгра комплекса, која се затим користи за одређивање апсорпционог спектра истог узорка сакупљеног у пуферу. Коефицијент екстинкције. паралелно. Три поновљена мерења су извршена за сваки узорак, а просечна апсорбанција максимума BChl Qy је коришћена за израчунавање. Коефицијент екстинкције RC-LH114-W мерен на 878 nm је 3280±140 mM-1 cm-1, док је коефицијент екстинкције RC-LH116 мерен на 880 nm 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 је квантификован према методи у (52). Укратко, HPLC анализа са обрнутом фазом (RP-HPLC) је извршена коришћењем Agilent 1200 HPLC система. Растворити око 0,02 nmol RC-LH116 или RC-LH114-W у 50μl смесе метанол:хлороформ у односу 50:50 који садржи 0,02% (w/v) фери хлорида и убризгати претходно уравнотежену Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm растворену у 1 ml-1 min-1 на 40°C у HPLC растварачу (80:20 метанол:2-пропанол) на колони димензија ×25 cm. Извршити изократску елуцију у HPLC растварачу да би се пратила апсорбанција на 275 nm (UQ10), 450 nm (каротеноиди) и 780 nm (BChl) током 1 сата. Врх на хроматограму на 275 nm на 25,5 минута је интегрисан, који није садржао никаква друга детектабилна једињења. Интегрисана површина се користи за израчунавање моларне количине екстрахованог UQ10 у односу на калибрациону криву израчунату убризгавањем чистих стандарда од 0 до 5,8 nmol (слика S14). Сваки узорак је анализиран у три понављања, а пријављена грешка одговара стандардној девијацији просека.
Раствор који садржи RC-LH1 комплекс са максималном Qy апсорпцијом од 0,1 припремљен је са 30 μM редукованог цитохрома c2 из коњског срца (Merck, Велика Британија) и 0 до 50 μMUQ2 (Merck, Велика Британија). Три узорка од 1 ml су припремљена при свакој концентрацији UQ2 и инкубирана преко ноћи у мраку на 4°C како би се осигурала потпуна адаптација на мрак пре мерења. Раствор је стављен у OLIS RSM1000 модуларни спектрофотометар опремљен решетком пламена од 300 nm/линијском решетком од 500, улазним прорезима од 1,24 mm, средњим прорезима од 0,12 mm и излазним прорезима од 0,6 mm. Филтер пропусног опсега дужине 600 nm постављен је на улаз фотоцевчице за узорак и референтне фотомултипликаторске цеви како би се искључила побудна светлост. Апсорбанција је праћена на 550 nm са временом интеграције од 0,15 s. Побуђујућа светлост се емитује са 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., Велика Британија) преко оптичког кабла интензитета 90% помоћу DC2200 контролера (Thorlabs Ltd., Велика Британија) и емитује се ка извору светлости под углом од 90°. Мерни сноп је усмерен супротно огледалу како би вратио било коју светлост коју узорак није првобитно апсорбовао. Пратите апсорбанцију 10 s пре осветљења од 50 s. Затим је апсорбанција даље праћена 60 s у мраку како би се проценило у којој мери кинолол спонтано редукује цитохром c23+ (видети слику S8 за сирове податке).
Подаци су обрађени уклапањем линеарне почетне брзине у року од 0,5 до 10 s (у зависности од концентрације UQ2) и усредњавањем брзина сва три узорка при свакој концентрацији UQ2. Концентрација RC-LH1 израчуната помоћу одговарајућег коефицијента екстинкције коришћена је за претварање брзине у каталитичку ефикасност, приказана у програму Origin Pro 2019 (OriginLab, САД), и уклопљена у модел Михаелис-Ментена да би се одредиле привидне вредности Km и Kcat.
За мерења транзијентне апсорпције, узорак RC-LH1 је разблажен на ~2μM у IMAC пуферу који садржи 50 mM натријум аскорбата (Merck, САД) и 0,4 mM тербутина (Merck, САД). Аскорбинска киселина се користи као жртвени донор електрона, а терц-бутаклофен се користи као QB инхибитор како би се осигурало да главни RC донор остане редукован (то јест, да се не фотооксидује) током целог процеса мерења. Приближно 3 ml узорка се додаје у прилагођену ротирајућу ћелију (пречника око 0,1 m, 350 RPM) са дужином оптичког пута од 2 mm како би се осигурало да узорак у ласерском путу има довољно времена за адаптацију на мрак између импулса побуђивања. Користите ласерске импулсе од ~100 fs за појачавање Ti:Sapphire ласерског система (Spectra Physics, САД) да бисте побудили узорак на 880 nm брзином понављања од 1 kHz (20 nJ за NIR или 100 nJ за Vis). Пре прикупљања података, изложите узорак побуђивачкој светлости око 30 минута. Излагање ће изазвати инактивацију QA (могуће смањење QA једном или два пута). Међутим, имајте на уму да је овај процес реверзибилан јер ће се након дугог периода адаптације на мрак, RC полако вратити на QA активност. Helios спектрометар (Ultrafast Systems, САД) је коришћен за мерење пролазних спектара са временом кашњења од -10 до 7000 ps. Користите Surface Xplorer софтвер (Ultrafast Systems, САД) да бисте разгруписали скупове података, а затим их спојили и стандардизовали. Користите CarpetView софтверски пакет (Light Conversion Ltd., Литванија) да бисте користили комбиновани скуп података за добијање диференцијалних спектара везаних за распад или користите функцију која конволуира више експонената са одзивом инструмента како би се уклопила у спектралну еволуцију једне таласне дужине у програму Origin (OriginLab, САД).
Као што је горе поменуто (53), припремљен је фотосинтетски филм који садржи LH1 комплекс коме недостају и RC и периферна LH2 антена. Мембрана је разблажена у 20 mM tris (pH 8,0), а затим стављена у кварцну кивету са оптичком путањом од 2 mm. Ласерски импулс од 30nJ је коришћен за побуђивање узорка на 540 nm са временом кашњења од -10 до 7000 ps. Обрадите скуп података као што је описано за Rps.pal узорак.
Мембрана је пелетирана центрифугирањем на 150.000 RCF током 2 сата на 4°C, а затим је њена апсорбанција на 880 nm ресуспендована у 20 mM tris-HCl (pH 8,0) и 200 mM NaCl. Растворити мембрану спорим мешањем у 2% (w/v) β-DDM током 1 сата у мраку на 4°C. Узорак је разблажен у 100 mM триетиламонијум карбонату (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) до концентрације протеина од 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad анализа). Даља обрада је спроведена према претходно објављеној методи (54), почевши од разблаживања 50 μg протеина у укупно 50 μl TEAB-а који садржи 1% (w/v) натријум лаурата (Merck, UK). Након соникације током 60 секунди, редукован је са 5 mM трис(2-карбоксиетил)фосфина (Merck, Велика Британија) на 37°C током 30 минута. За S-алкилацију, инкубирати узорак са 10 mM метил S-метилтиометансулфонатом (Merck, Велика Британија) и додати га из основног раствора изопропанола од 200 mM током 10 минута на собној температури. Протеолитичка дигестија је спроведена додавањем 2 μg смеше трипсина/ендопротеиназе Lys-C (Promega Велика Британија) и инкубирана на 37°C током 3 сата. Лауратни сурфактант је екстрахован додавањем 50 μl етил ацетата и 10 μl 10% (v/v) трифлуоросирћетне киселине LC квалитета (TFA; Thermo Fisher Scientific, Велика Британија) и вортексирањем током 60 секунди. Раздвајање фаза је убрзано центрифугирањем на 15.700 RCF током 5 минута. Према протоколу произвођача, коришћена је C18 спин колона (Thermo Fisher Scientific, Велика Британија) за пажљиво аспирирање и одсољавање доње фазе која садржи пептид. Након сушења вакуумским центрифугирањем, узорак је растворен у 0,5% TFA и 3% ацетонитрилу, а 500 нг је анализирано нанофлоу RP хроматографијом у комбинацији са масеном спектрометријом користећи системске параметре детаљно описане претходно.
Користите MaxQuant v.1.5.3.30 (56) за идентификацију и квантификацију протеина како бисте претражили базу података протеома Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Подаци о протеомици масене спектрометрије су депоновани у ProteomeXchange Alliance преко PRIDE партнерског репозиторијума (http://proteomecentral.proteomexchange.org) под идентификатором скупа података PXD020402.
За анализу помоћу RPLC спрегнуте са електроспреј јонизацијском масеном спектрометријом, RC-LH1 комплекс је припремљен од дивљег типа Rps. Користећи претходно објављену методу (16), концентрација протеина произведена у ћелијама palustris била је 2 mg ml-1 у 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl и 0,03% (w/v) β-(Bio-Rad анализа)) DDM. Према протоколу произвођача, користите 2D комплет за пречишћавање (GE Healthcare, САД) да бисте екстраховали 10 μg протеина методом таложења и растворили талог у 20 μl 60% (v/v) мравље киселине (FA), 20% (v/v) ацетонитрила и 20% (v/v) воде. Пет микролитара је анализирано помоћу RPLC (Dionex RSLC) спрегнуте са масеном спектрометријом (Maxis UHR-TOF, Bruker). Користите MabPac колону 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Велика Британија) за раздвајање на 60°C и 100 μl min -1, са градијентом од 85% (v / v) растварача А [0,1% (v / v) FA и 0,02% (V/v) водени раствор TFA] до 85% (v/v) растварача Б [0,1% (v/v) FA и 0,02% (v/v) у 90% (v/v) ацетонитрил TFA]. Користећи стандардни извор јонизације електроспрејом и подразумеване параметре дуже од 60 минута, масени спектрометар постиже од 100 до 2750 m/z (однос масе и наелектрисања). Уз помоћ алата FindPept на порталу биоинформатичких ресурса ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), мапирајте масени спектар на подјединице комплекса.
Ћелије су гајене 72 сата под 100 мл NF-слабог (10μMm-2 s-1), средњег (30μMm-2 s-1) или јаког (300μMm-2 s-1) светла. М22 медијум (М22 медијум у коме је амонијум сулфат изостављен, а натријум сукцинат замењен натријум ацетатом) у бочици са затварачем од 100 мл (23). У пет циклуса од 30 секунди, стаклене перле од 0,1 микрона су додаване у запремински однос 1:1 да би се ћелије лизирале и хлађене на леду 5 минута. Нерастворљива материја, неразбијене ћелије и стаклене перле су уклоњене центрифугирањем на 16.000 RCF током 10 минута у стоној микроцентрифуги. Мембрана је одвојена у Ti 70.1 ротору са 100.000 RCF у 20 mM tris-HCl (pH 8,0) са градијентом сахарозе 40/15% (w/w) током 10 сати.
Као што је описано у нашем претходном раду, имунодетекција His ознаке на PufW (16). Укратко, пречишћени језгрови комплекс (11,8 nM) или мембрана која садржи исту концентрацију RC (одређену оксидацијом одузимањем редукованог спектра разлике и упаривањем оптерећења на обојеном гелу) у 2x SDS пуферу за пуњење (Merck, Велика Британија) разблаженом два пута. Протеини су раздвојени на реплици 12% бис-трис NuPage гела (Thermo Fisher Scientific, Велика Британија). Гел је обојен са Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Велика Британија) да би се учитала и визуализовала RC-L подјединица. Протеин на другом гелу је пребачен на метанолом активирану поливинилиден флуоридну (PVDF) мембрану (Thermo Fisher Scientific, Велика Британија) за имунотест. PVDF мембрана је блокирана у 50 mM трис-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 и 5% (w/v) обраном млеку у праху, а затим инкубирана са примарним антителом против His (у пуферу за разблажење антитела [50 mM трис-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl и 0,05% (v/v) Tween-20] у 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, САД) током 4 сата. Након испирања 3 пута по 5 минута у пуферу за антитела, мембрана је комбинована са секундарним антителом против миша из ренове пероксидазе (Sigma-Aldrich, Велика Британија) (разблажено 1:10.000 у пуферу за антитела). Инкубирана је да би се омогућила детекција (5 минута након 3 испирања у пуферу за антитела) коришћењем WESTAR ETA C 2.0 хемилуминисцентног супстрата (Cyanagen, Италија) и Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Велика Британија).
Цртање расподеле интензитета сваког обојеног гела или имунотест траке, интегрисање површине испод врха и израчунавање односа интензитета RC-L (обојени гел) и Protein-W (имунотест), у ImageJ (57) обради слику. Ови односи су конвертовани у моларне односе претпостављајући да је однос RC-L према protein-W у чистом узорку RC-LH114-W био 1:1 и нормализујући цео скуп података у складу са тим.
За додатне материјале за овај чланак, погледајте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ово је чланак отвореног приступа дистрибуиран под условима лиценце Creative Commons Attribution. Чланак дозвољава неограничено коришћење, дистрибуцију и репродукцију у било ком медијуму под условом да је оригинални рад правилно цитиран.
Напомена: Молимо вас да наведете своју адресу е-поште само да би особа коју препоручујете страници знала да желите да види имејл и да то није спам. Нећемо бележити никакве адресе е-поште.
Ово питање се користи да се провери да ли сте посетилац и спречи аутоматско слање спама.
Дејвид Џ. К. Свејнсбери, Парк Ћиан, Филип Џ. Џексон, Кејтлин М. Ферис, Даријуш М. Ниџвиедзки, Елизабет К. Мартин, Дејвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребека Ф. Томпсон, Нил А. Рансон, Данијел П. Каниф, Марк Џ. Дикман, Дјуи Холтен, Кристин Кирмајер, Ендру Хичкок, К. Нил Хантер
Структура високе резолуције комплекса светлосне замке 1 у реакционом центру пружа нове увиде у динамику кинона.
Дејвид Џ. К. Свејнсбери, Парк Ћиан, Филип Џ. Џексон, Кејтлин М. Ферис, Даријуш М. Ниџвиедзки, Елизабет К. Мартин, Дејвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребека Ф. Томпсон, Нил А. Рансон, Данијел П. Каниф, Марк Џ. Дикман, Дјуи Холтен, Кристин Кирмајер, Ендру Хичкок, К. Нил Хантер
Структура високе резолуције комплекса светлосне замке 1 у реакционом центру пружа нове увиде у динамику кинона.
©2021 Америчко удружење за унапређење науке. сва права задржана. АААС је партнер ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ЦХОРУС, ЦЛОЦКСС, ЦроссРеф и ЦОУНТЕР. СциенцеАдванцес ИССН 2375-2548.