Чланак је део истраживачке теме „Напредне технологије биоремедијације и процеси рециклаже синтетичких органских једињења (СОЦ)“. Погледајте свих 14 чланака
Полициклични ароматични угљоводоници (ПАУ) мале молекулске тежине, као што су нафтален и супституисани нафталени (метилнафтален, нафтојева киселина, 1-нафтил-N-метилкарбамат, итд.), широко се користе у различитим индустријама и генотоксични су, мутагени и/или канцерогени за организме. Ова синтетичка органска једињења (СОЦ) или ксенобиотици сматрају се приоритетним загађивачима и представљају озбиљну претњу по глобалну животну средину и јавно здравље. Интензитет људских активности (нпр. гасификација угља, рафинирање нафте, емисије из возила и пољопривредне примене) одређује концентрацију, судбину и транспорт ових свеприсутних и постојаних једињења. Поред физичких и хемијских метода третмана/уклањања, зелене и еколошки прихватљиве технологије попут биоремедијације, које користе микроорганизме способне да потпуно разграде ПОЦ или их претворе у нетоксичне нуспроизводе, појавиле су се као безбедна, исплатива и перспективна алтернатива. Различите бактеријске врсте које припадају фила Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia и Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus и Paenibacillus) и Actinobacteria (Rhodococcus и Arthrobacter) у микробиоти земљишта показале су способност разградње различитих органских једињења. Метаболичке студије, геномика и метагеномска анализа помажу нам да разумемо катаболичку сложеност и разноликост присутну у овим једноставним облицима живота, што се може даље применити за ефикасну биоразградњу. Дугорочно постојање ПАХ-ова довело је до појаве нових фенотипова разградње кроз хоризонтални пренос гена коришћењем генетских елемената као што су плазмиди, транспозони, бактериофаги, геномска острва и интегративни коњугативни елементи. Системска биологија и генетски инжењеринг специфичних изолата или моделних заједница (конзорцијума) могу омогућити свеобухватну, брзу и ефикасну биоремедијацију ових ПАХ-ова кроз синергијске ефекте. У овом прегледу, фокусирамо се на различите метаболичке путеве и разноликост, генетски састав и разноликост, као и ћелијске одговоре/адаптације бактерија које разграђују нафтален и супституисани нафтален. Ово ће пружити еколошке информације за примену на терену и оптимизацију сојева за ефикасну биоремедијацију.
Брзи развој индустрија (петрохемикалије, пољопривреде, фармацеутских производа, текстилних боја, козметике итд.) допринео је глобалном економском просперитету и побољшању животног стандарда. Овај експоненцијални развој резултирао је производњом великог броја синтетичких органских једињења (СОЦ), која се користе за производњу разних производа. Ова страна једињења или СОЦ укључују полицикличне ароматичне угљоводонике (ПАХ), пестициде, хербициде, пластификаторе, боје, фармацеутске производе, органофосфате, успориваче горења, испарљиве органске раствараче итд. Она се емитују у атмосферу, водене и копнене екосистеме где имају вишедимензионалне утицаје, узрокујући штетне ефекте на различите биоформе кроз промену физичко-хемијских својстава и структуре заједнице (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Многи ароматични загађивачи имају јак и деструктиван утицај на многе нетакнуте екосистеме/вруће тачке биодиверзитета (нпр. корални гребени, арктичке/антарктичке ледене плоче, високопланинска језера, дубокоморски седименти итд.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Недавне геомикробиолошке студије су показале да таложење синтетичких органских материја (нпр. ароматичних загађивача) и њихових деривата на површинама вештачких структура (изграђеног окружења) (нпр. локалитета културне баштине и споменици направљени од гранита, камена, дрвета и метала) убрзава њихову деградацију (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Људске активности могу интензивирати и погоршати биолошку деградацију споменика и зграда кроз загађење ваздуха и климатске промене (Liu et al. 2020). Ови органски загађивачи реагују са воденом паром у атмосфери и таложе се на структури, узрокујући физичку и хемијску деградацију материјала. Биодеградација је широко препозната као непожељне промене у изгледу и својствима материјала изазване живим организмима које утичу на њихово очување (Pochon and Jaton, 1967). Даље микробно дејство (метаболизам) ових једињења може смањити структурни интегритет, ефикасност конзервације и културну вредност (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). С друге стране, у неким случајевима, утврђено је да је микробна адаптација и одговор на ове структуре корисна јер оне формирају биофилмове и друге заштитне коре које смањују брзину распадања/разградње (Martino, 2016). Стога, развој ефикасних дугорочних одрживих стратегија конзервације камених, металних и дрвених споменика захтева темељно разумевање кључних процеса укључених у овај процес. У поређењу са природним процесима (геолошки процеси, шумски пожари, вулканске ерупције, биљне и бактеријске реакције), људске активности доводе до ослобађања великих количина полицикличних ароматичних угљоводоника (PAH) и другог органског угљеника (OC) у екосистеме. Многи полиарахилни аромофилни једињења (ПАХ) који се користе у пољопривреди (инсектициди и пестициди као што су ДДТ, атразин, карбарил, пентахлорфенол итд.), индустрији (сирова нафта, нафтни муљ/отпад, пластика добијена из нафте, ПЦБ-и, пластификатори, детерџенти, дезинфекциона средства, фумиганти, мириси и конзерванси), производима за личну негу (креме за сунчање, дезинфекциона средства, репеленти за инсекте и полициклични мошуси) и муницији (експлозиви као што је 2,4,6-ТНТ) су потенцијални ксенобиотици који могу утицати на здравље планете (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna and Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Ова листа се може проширити и укључити једињења добијена из нафте (лож уља, мазива, асфалтене), биопластике високе молекулске тежине и јонске течности (Amde et al., 2015). Табела 1 наводи различите ароматичне загађиваче и њихову примену у различитим индустријама. Последњих година, антропогене емисије испарљивих органских једињења, као и угљен-диоксида и других гасова стаклене баште, почеле су да се повећавају (Dvorak et al., 2017). Међутим, антропогени утицаји значајно премашују природне. Поред тога, открили смо да одређени број органских једињења (SOC) опстаје у многим еколошким срединама и да је идентификован као нови загађивачи са негативним ефектима на биоме (Слика 1). Агенције за заштиту животне средине, попут Агенције за заштиту животне средине Сједињених Држава (USEPA), уврстиле су многе од ових загађивача на своју листу приоритета због њихових цитотоксичних, генотоксичних, мутагених и канцерогених својстава. Стога су потребни строги прописи о одлагању и ефикасне стратегије за третман/уклањање отпада из контаминираних екосистема. Различите физичке и хемијске методе третмана, као што су пиролиза, оксидативни термички третман, аерација ваздуха, одлагање на депоније, спаљивање итд., су неефикасне и скупе и стварају корозивне, токсичне и тешко обрадиве нуспроизводе. Са све већом глобалном еколошком свешћу, микроорганизми способни да разграде ове загађиваче и њихове деривате (као што су халогеновани, нитро, алкил и/или метил) привлаче све већу пажњу (Fennell et al., 2004; Haritash and Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Употреба ових аутохтоних кандидат микроорганизама, самих или у мешовитим културама (колонијама) за уклањање ароматичних загађивача, има предности у погледу еколошке безбедности, трошкова, ефикасности, ефективности и одрживости. Истраживачи такође истражују интеграцију микробних процеса са електрохемијским редокс методама, наиме биоелектрохемијским системима (BES), као обећавајућу технологију за третман/уклањање загађивача (Huang et al., 2011). БЕС технологија привлачи све већу пажњу због своје високе ефикасности, ниске цене, еколошке безбедности, рада на собној температури, биокомпатибилних материјала и могућности опоравка вредних нуспроизвода (нпр. електричне енергије, горива и хемикалија) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Појава високопропусног секвенцирања генома и омикских алата/метода пружила је мноштво нових информација о генетској регулацији, протеомици и флуксомици реакција различитих микроорганизама разградње. Комбиновање ових алата са системском биологијом додатно је унапредило наше разумевање селекције и финог подешавања циљних катаболичких путева код микроорганизама (тј. метаболички дизајн) како би се постигла ефикасна и ефективна биоразградња. Да бисмо дизајнирали ефикасне стратегије биоремедијације користећи одговарајуће кандидатске микроорганизме, потребно је да разумемо биохемијски потенцијал, метаболичку разноликост, генетски састав и екологију (аутоекологија/синекологија) микроорганизама.
Сл. 1. Извори и путеви нискомолекуларних ПАХ кроз различите животне средине и различите факторе који утичу на биоту. Испрекидане линије представљају интеракције између елемената екосистема.
У овом прегледу, покушали смо да сумирамо податке о разградњи једноставних ПАХ као што су нафтален и супституисани нафталени од стране различитих бактеријских изолата, покривајући метаболичке путеве и разноликост, ензиме укључене у разградњу, састав/садржај и разноликост гена, ћелијске одговоре и различите аспекте биоремедијације. Разумевање биохемијских и молекуларних нивоа ће помоћи у идентификацији одговарајућих сојева домаћина и њиховом даљем генетском инжењерингу за ефикасну биоремедијацију таквих приоритетних загађивача. Ово ће помоћи у развоју стратегија за успостављање локално специфичних бактеријских конзорција за ефикасну биоремедијацију.
Присуство великог броја токсичних и опасних ароматичних једињења (која задовољавају Хукелово правило 4n + 2π електрона, n = 1, 2, 3, ...) представља озбиљну претњу за различите медије животне средине као што су ваздух, земљиште, седименти, површинске и подземне воде (Puglisi et al., 2007). Ова једињења имају појединачне бензенске прстенове (моноциклични) или вишеструке бензенске прстенове (полициклични) распоређене у линеарном, угаоном или кластер облику и показују стабилност (стабилност/нестабилност) у животној средини због високе негативне резонантне енергије и инертности (инертности), што се може објаснити њиховом хидрофобношћу и редукованим стањем. Када се ароматични прстен даље замени метил (-CH3), карбоксил (-COOH), хидроксил (-OH) или сулфонатним (-HSO3) групама, он постаје стабилнији, има јачи афинитет за макромолекуле и биоакумулира се у биолошким системима (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Неки полициклични ароматични угљоводоници мале молекулске тежине (НМВАХ), као што су нафтален и његови деривати [метилнафтален, нафтојева киселина, нафталенсулфонат и 1-нафтил Н-метилкарбамат (карбарил)], уврштени су на листу приоритетних органских загађивача од стране Агенције за заштиту животне средине САД као генотоксични, мутагени и/или канцерогени (Cerniglia, 1984). Ослобађање ове класе НМ-ПАХ у животну средину може довести до биоакумулације ових једињења на свим нивоима ланца исхране, што утиче на здравље екосистема (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Извори и путеви ПАХ до биоте су првенствено кроз миграцију и интеракције између различитих компоненти екосистема као што су земљиште, подземне воде, површинске воде, усеви и атмосфера (Arey and Atkinson, 2003). Слика 1 приказује интеракције и дистрибуцију различитих ПАХ ниске молекулске тежине у екосистемима и њихове путеве до биоте/изложености људи. ПАХ се таложе на површинама као резултат загађења ваздуха и кроз миграцију (дрејф) емисија возила, индустријских издувних гасова (гасификација угља, сагоревање и производња кокса) и њихово таложење. Индустријске активности као што су производња синтетичких текстила, боја и фарба; конзервација дрвета; прерада гуме; активности производње цемента; производња пестицида; и пољопривредне примене су главни извори ПАХ у копненим и воденим системима (Bamforth and Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Студије су показале да су земљишта у приградским и урбаним подручјима, близу аутопутева и у великим градовима подложнија полицикличним ароматичним угљоводоницима (ПАХ) због емисија из електрана, грејања стамбених објеката, оптерећења ваздушним и друмским саобраћајем и грађевинских активности (Suman et al., 2016). (2008) је показало да су ПАХ у земљишту близу путева у Њу Орлеансу, Луизијана, САД, били високи и до 7189 μг/кг, док су на отвореном простору били само 2404 μг/кг. Слично томе, нивои ПАХ и до 300 μг/кг су пријављени у подручјима близу локација за гасификацију угља у неколико градова у САД (Kanaly and Harayama, 2000; Bamforth and Singleton, 2005). Пријављено је да земљишта из разних индијских градова као што су Делхи (Sharma et al., 2008), Агра (Dubey et al., 2014), Мумбај (Kulkarni and Venkataraman, 2000) и Висакхапатнам (Kulkarni et al., 2014) садрже високе концентрације ПАХ. Ароматична једињења се лакше адсорбују на честице земљишта, органску материју и минерале глине, те тако постају главни понори угљеника у екосистемима (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Главни извори ПАХ у воденим екосистемима су падавине (влажне/суве падавине и водена пара), градски отицај, испуштање отпадних вода, обнављање подземних вода итд. (Srogi, 2007). Процењује се да око 80% ПАХ у морским екосистемима потиче од падавина, седиментације и испуштања отпада (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Веће концентрације ПАХ у површинским водама или процедним водама са одлагалишта чврстог отпада на крају продиру у подземне воде, што представља велику претњу по јавно здравље, јер више од 70% становништва у Јужној и Југоисточној Азији пије подземне воде (Duttagupta et al., 2019). Недавна студија Дутагупте и др. (2020) о анализама река (32) и подземних вода (235) из Западног Бенгала, Индија, открила је да се процењује да 53% градских становника и 44% сеоских становника (укупно 20 милиона становника) може бити изложено нафталену (4,9–10,6 μг/Л) и његовим дериватима. Различити обрасци коришћења земљишта и повећана екстракција подземних вода сматрају се главним факторима који контролишу вертикални транспорт (адвекцију) ПАХ ниске молекулске тежине у подземљу. Утврђено је да су пољопривредни отпад, испуштање комуналних и индустријских отпадних вода и испуштање чврстог отпада/смећа погођени ПАХ у речним сливовима и подземним седиментима. Атмосферске падавине додатно погоршавају загађење ПАХ. Високе концентрације ПАХ и њихових алкил деривата (укупно 51) забележене су у рекама/сливовима широм света, као што су реке Фрејзер, Луан, Денсо, Мисури, Анакостија, Ебро и Делавер (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). У седиментима слива реке Ганг, нафтален и фенантрен су били најзначајнији (детектовани у 70% узорака) (Duttagupta et al., 2019). Штавише, студије су показале да хлорисање воде за пиће може довести до стварања токсичнијих оксигенисаних и хлорисаних ПАХ (Manoli and Samara, 1999). ПАХ се акумулирају у житарицама, воћу и поврћу као резултат апсорпције од стране биљака из контаминираног земљишта, подземних вода и падавина (Fismes et al., 2002). Многи водени организми попут рибе, дагњи, шкољки и шкампа контаминирани су ПАХ конзумирањем контаминиране хране и морске воде, као и кроз ткива и кожу (Mackay and Fraser, 2000). Методе кувања/обраде као што су роштиљање, печење, димљење, пржење, сушење, печење у пећи и кување на ћумур такође могу довести до значајних количина ПАХ у храни. То у великој мери зависи од избора материјала за димљење, садржаја фенолних/ароматичних угљоводоника, поступка кувања, типа грејача, садржаја влаге, снабдевања кисеоником и температуре сагоревања (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Полициклични ароматични угљоводоници (ПАХ) су такође откривени у млеку у различитим концентрацијама (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Акумулација ових ПАХ у храни такође зависи од физичко-хемијских својстава хране, док су њихови токсични ефекти повезани са физиолошким функцијама, метаболичком активношћу, апсорпцијом, дистрибуцијом и расподелом у телу (Mechini et al., 2011).
Токсичност и штетни ефекти полицикличних ароматичних угљоводоника (ПАУ) познати су већ дуго времена (Cherniglia, 1984). Полициклични ароматични угљоводоници мале молекулске тежине (НМВ-ПАУ) (два до три прстена) могу се ковалентно везати за различите макромолекуле као што су ДНК, РНК и протеини и канцерогени су (Santarelli et al., 2008). Због своје хидрофобне природе, одвојени су липидним мембранама. Код људи, цитохром П450 монооксигеназе оксидују ПАУ до епоксида, од којих су неки веома реактивни (нпр., бедиол епоксид) и могу довести до трансформације нормалних ћелија у малигне (Marston et al., 2001). Поред тога, производи трансформације ПАУ као што су хинони, феноли, епоксиди, диоли итд. су токсичнији од матичних једињења. Неки ПАХ и њихови метаболички интермедијери могу утицати на хормоне и разне ензиме у метаболизму, чиме негативно утичу на раст, централни нервни систем, репродуктивни и имуни систем (Swetha and Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Пријављено је да краткотрајно излагање ПАХ мале молекулске тежине изазива оштећену функцију плућа и тромбозу код астматичара и да повећава ризик од рака коже, плућа, бешике и гастроинтестиналног тракта (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Студије на животињама су такође показале да излагање ПАХ може имати негативне ефекте на репродуктивну функцију и развој и може изазвати катаракту, оштећење бубрега и јетре и жутицу. Показано је да различити производи биотрансформације ПАХ, као што су диоли, епоксиди, хинони и слободни радикали (катјони), формирају ДНК адукте. Показано је да стабилни адукти мењају механизам репликације ДНК, док нестабилни адукти могу депуринирати ДНК (углавном до аденина, а понекад и до гуанина); оба могу генерисати грешке које доводе до мутација (Schweigert et al. 2001). Поред тога, хинони (бензо-/пан-) могу генерисати реактивне врсте кисеоника (ROS), узрокујући фатална оштећења ДНК и других макромолекула, чиме утичу на функцију/виталност ткива (Ewa and Danuta 2017). Пријављено је да хронично излагање ниским концентрацијама пирен, бифенил и нафтален изазива рак код експерименталних животиња (Diggs et al. 2012). Због њихове смртоносне токсичности, чишћење/уклањање ових ПАХ са погођених/контаминираних места је приоритет.
Различите физичке и хемијске методе су коришћене за уклањање ПАХ-ова са контаминираних места/окружења. Процеси као што су спаљивање, дехлоринација, УВ оксидација, фиксација и екстракција растварачем имају многе недостатке, укључујући стварање токсичних нуспроизвода, сложеност процеса, безбедносна и регулаторна питања, ниску ефикасност и високе трошкове. Међутим, микробна биоразградња (названа биоремедијација) је обећавајући алтернативни приступ који укључује употребу микроорганизама у облику чистих култура или колонија. У поређењу са физичким и хемијским методама, овај процес је еколошки прихватљив, неинвазиван, исплатив и одржив. Биоремедијација се може спроводити на погођеном месту (in situ) или на посебно припремљеном месту (ex situ) и стога се сматра одрживијом методом ремедијације од традиционалних физичких и хемијских метода (Juhasz and Naidu, 2000; Andreoni and Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Разумевање микробних метаболичких корака укључених у разградњу ароматичних загађивача има огромне научне и економске импликације на еколошку и еколошку одрживост. Процењује се да се 2,1×10^18 грама угљеника (C) складишти у седиментима и органским једињењима (тј. нафти, природном гасу и угљу, тј. фосилним горивима) широм света, што значајно доприноси глобалном циклусу угљеника. Међутим, брза индустријализација, екстракција фосилних горива и људске активности исцрпљују ове литосферске резервоаре угљеника, ослобађајући процењених 5,5×10^15 г органског угљеника (као загађивача) у атмосферу годишње (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Већина овог органског угљеника улази у копнене и морске екосистеме путем седиментације, транспорта и отицања. Поред тога, нови синтетички загађивачи добијени из фосилних горива, као што су пластика, пластификатори и стабилизатори пластике (фталати и њихови изомери), озбиљно загађују морске, земљишне и водене екосистеме и њихов биоту, чиме се погоршавају глобални климатски ризики. Различите врсте микропластике, нанопластике, пластичних фрагмената и њихових токсичних мономерних производа добијених из полиетилен терефталата (ПЕТ) акумулирале су се у Тихом океану између Северне Америке и Југоисточне Азије, формирајући „Велику пацифичку мрљу смећа“, штетећи морском свету (Newell et al., 2020). Научне студије су доказале да није могуће уклонити такве загађиваче/отпад било којим физичким или хемијским методама. У овом контексту, најкориснији микроорганизми су они који су способни да оксидативно метаболишу загађиваче у угљен-диоксид, хемијску енергију и друге нетоксичне нуспроизводе који на крају улазе у друге процесе кружења хранљивих материја (H, O, N, S, P, Fe, итд.). Стога је разумевање микробне екофизиологије минерализације ароматичних загађивача и њене контроле животне средине кључно за процену микробног циклуса угљеника, нето буџета угљеника и будућих климатских ризика. С обзиром на хитну потребу за уклањањем таквих једињења из животне средине, појавиле су се разне еко-индустрије усмерене на чисте технологије. Алтернативно, валоризација индустријског отпада/отпадних хемикалија акумулираних у екосистемима (тј. приступ „од отпада до богатства“) сматра се једним од стубова циркуларне економије и циљева одрживог развоја (Close et al., 2012). Стога је разумевање метаболичких, ензимских и генетских аспеката ових потенцијалних кандидата за разградњу од највеће важности за ефикасно уклањање и биоремедијацију таквих ароматичних загађивача.
Међу многим ароматичним загађивачима, посебну пажњу посвећујемо PAH нискомолекуларним угљеним хидратима као што су нафтален и супституисани нафталени. Ова једињења су главне компоненте горива добијених из нафте, текстилних боја, производа широке потрошње, пестицида (нафталина и репелената против инсеката), пластификатора и танина и стога су широко распрострањена у многим екосистемима (Preuss et al., 2003). Недавни извештаји истичу акумулацију концентрација нафталена у седиментима водоносног слоја, подземним водама и подземним земљиштима, вадозним зонама и речним коритима, што указује на његову биоакумулацију у животној средини (Duttagupta et al., 2019, 2020). Табела 2 сумира физичко-хемијска својства, примену и здравствене ефекте нафталена и његових деривата. У поређењу са другим PAH високомолекуларним угљеним хидратима, нафтален и његови деривати су мање хидрофобни, растворљивији у води и широко распрострањени у екосистемима, па се често користе као моделни супстрати за проучавање метаболизма, генетике и метаболичке разноликости PAH. Велики број микроорганизама је у стању да метаболише нафтален и његове деривате, а доступне су свеобухватне информације о њиховим метаболичким путевима, ензимима и регулаторним карактеристикама (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Поред тога, нафтален и његови деривати су означени као прототипови једињења за процену загађења животне средине због њихове велике количине и биорасположивости. Агенција за заштиту животне средине САД процењује да су просечни нивои нафталена 5,19 μг по кубном метру из цигаретног дима, првенствено из непотпуног сагоревања, и 7,8 до 46 μг из споредног дима, док је изложеност креозоту и нафталену 100 до 10.000 пута већа (Preuss et al. 2003). Посебно је утврђено да нафтален има респираторну токсичност и канцерогеност специфичну за врсту, регион и пол. На основу студија на животињама, Међународна агенција за истраживање рака (IARC) класификовала је нафтален као „могући канцероген за људе“ (Група 2Б)1. Излагање супституисаним нафталенима, првенствено инхалацијом или парентералном (оралном) применом, узрокује оштећење плућног ткива и повећава учесталост тумора плућа код пацова и мишева (Национални токсиколошки програм 2). Акутни ефекти укључују мучнину, повраћање, бол у стомаку, дијареју, главобољу, конфузију, обилно знојење, грозницу, тахикардију итд. С друге стране, објављено је да је инсектицид широког спектра карбамат карбарил (1-нафтил Н-метилкарбамат) токсичан за водене бескичмењаке, водоземце, медоносне пчеле и људе и показано је да инхибира ацетилхолинестеразу изазивајући парализу (Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011). Стога је разумевање механизама микробне разградње, генетске регулације, ензимских и ћелијских реакција кључно за развој стратегија биоремедијације у контаминираним срединама.
Табела 2. Детаљне информације о физичко-хемијским својствима, употреби, методама идентификације и повезаним болестима нафталена и његових деривата.
У загађеним нишама, хидрофобни и липофилни ароматични загађивачи могу изазвати разне ћелијске ефекте на микробиом (заједницу) животне средине, као што су промене у флуидности мембране, пропустљивости мембране, отицање липидног двослоја, поремећај преноса енергије (ланац транспорта електрона/моторна сила протона) и активност протеина повезаних са мембраном (Sikkema et al., 1995). Поред тога, неки растворљиви интермедијери као што су катехоли и хинони генеришу реактивне врсте кисеоника (ROS) и формирају адукте са ДНК и протеинима (Penning et al., 1999). Стога, обиље таквих једињења у екосистемима врши селективни притисак на микробне заједнице да постану ефикасни разградитељи на различитим физиолошким нивоима, укључујући усвајање/транспорт, интрацелуларну трансформацију, асимилацију/коришћење и компартментализацију.
Претрага Пројекта рибозомалне базе података II (RDP-II) открила је да је укупно 926 бактеријских врста изоловано из медијума или култура обогаћивања контаминираних нафталеном или његовим дериватима. Група Proteobacteria имала је највећи број представника (n = 755), затим Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) и некласификоване бактерије (8) (Слика 2). Представници γ-Proteobacteria (Pseudomonadales и Xanthomonadales) доминирали су свим грам-негативним групама са високим садржајем G+C (54%), док су Clostridiales и Bacillales (30%) биле грам-позитивне групе са ниским садржајем G+C. Пријављено је да су Pseudomonas (највећи број, 338 врста) способне да разграде нафтален и његове метил деривате у различитим загађеним екосистемима (катран угља, нафта, сирова нафта, муљ, изливања нафте, отпадне воде, органски отпад и депоније), као и у нетакнутим екосистемима (земљиште, реке, седименти и подземне воде) (Слика 2). Штавише, студије обогаћивања и метагеномска анализа неких од ових региона откриле су да некултивисане врсте Legionella и Clostridium могу имати капацитет разградње, што указује на потребу за култивацијом ових бактерија како би се проучили нови путеви и метаболичка разноликост.
Сл. 2. Таксономска разноликост и еколошка дистрибуција бактеријских представника у срединама контаминираним нафталеном и дериватима нафталена.
Међу различитим микроорганизмима који разграђују ароматичне угљоводонике, већина је способна да разгради нафтален као једини извор угљеника и енергије. Редослед догађаја укључених у метаболизам нафталена описан је за Pseudomonas sp. (сојеви: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 и CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 и други сојеви (ND6 и AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis and Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Метаболизам покреће вишекомпонентна диоксигеназа [нафтален диоксигеназа (NDO), диоксигеназа која хидроксилише прстен] која катализује оксидацију једног од ароматичних прстенова нафталена користећи молекуларни кисеоник као други супстрат, претварајући нафтален у цис-нафталендиол (Слика 3). Цис-дихидродиол се претвара у 1,2-дихидроксинафтален помоћу дехидрогеназе. Сојеви који цепају прстен диоксигеназа, 1,2-дихидроксинафтален диоксигеназа (12DHNDO), претвара 1,2-дихидроксинафтален у 2-хидроксихромен-2-карбоксилну киселину. Ензимска цис-транс изомеризација производи транс-о-хидроксибензилиденпируват, који се цепа хидратазном алдолазом на салицилни алдехид и пируват. Органска киселина пируват је била прво C3 једињење изведено из угљеничног скелета нафталена и усмерено у централни угљенични пут. Поред тога, NAD+-зависна салицилалдехид дехидрогеназа претвара салицилалдехид у салицилну киселину. Метаболизам у овој фази назива се „горњи пут“ разградње нафталена. Овај пут је веома чест код већине бактерија које разграђују нафтален. Међутим, постоји неколико изузетака; на пример, код термофилног Bacillus hamburgii 2, разградњу нафталена покреће нафтален 2,3-диоксигеназа да би се формирао 2,3-дихидроксинафтален (Аннвеилер ет ал., 2000).
Слика 3. Путеви разградње нафталена, метилнафталена, нафтојеве киселине и карбарила. Заокружени бројеви представљају ензиме одговорне за секвенцијалну конверзију нафталена и његових деривата у накнадне производе. 1 — нафтален диоксигеназа (NDO); 2, цис-дихидродиол дехидрогеназа; 3, 1,2-дихидроксинафтален диоксигеназа; 4, изомераза 2-хидроксихромен-2-карбоксилне киселине; 5, транс-О-хидроксибензилиденпируват хидратаза алдолаза; 6, салицилалдехид дехидрогеназа; 7, салицилат 1-хидроксилаза; 8, катехол 2,3-диоксигеназа (C23DO); 9, 2-хидроксимуконат семиалдехид дехидрогеназа; 10, 2-оксопент-4-еноат хидратаза; 11, 4-хидрокси-2-оксопентаноат алдолаза; 12, ацеталдехид дехидрогеназа; 13, катехол-1,2-диоксигеназа (C12DO); 14, муконат циклоизомераза; 15, муконолактон делта-изомераза; 16, β-кетоадипатенолактон хидролаза; 17, β-кетоадипат сукцинил-CoA трансфераза; 18, β-кетоадипат-CoA тиолаза; 19, сукцинил-CoA: ацетил-CoA сукцинилтрансфераза; 20, салицилат 5-хидроксилаза; 21 – гентизам 1,2-диоксигеназа (GDO); 22, малеилпируват изомераза; 23, фумарилпируват хидролаза; 24, метилнафтален хидроксилаза (NDO); 25, хидроксиметилнафтален дехидрогеназа; 26, нафталехид дехидрогеназа; 27, 3-формилсалицилна киселина оксидаза; 28, хидроксиизофталат декарбоксилаза; 29, карбарил хидролаза (CH); 30, 1-нафтол-2-хидроксилаза.
У зависности од организма и његовог генетског састава, резултујућа салицилна киселина се даље метаболише или путем катехолног пута користећи салицилат 1-хидроксилазу (S1H) или путем гентизатног пута користећи салицилат 5-хидроксилазу (S5H) (Слика 3). Пошто је салицилна киселина главни интермедијер у метаболизму нафталена (горњи пут), кораци од салицилне киселине до TCA интермедијера се често називају доњим путем, а гени су организовани у један оперон. Уобичајено је видети да су гени у оперону горњег пута (nah) и оперону доњег пута (sal) регулисани заједничким регулаторним факторима; на пример, NahR и салицилна киселина делују као индуктори, омогућавајући обема оперонима да потпуно метаболишу нафтален (Phale et al., 2019, 2020).
Поред тога, катехол се циклично цепа на 2-хидроксимуконат семиалдехид путем мета пута помоћу катехол 2,3-диоксигеназе (C23DO) (Yen et al., 1988) и даље се хидролизује помоћу 2-хидроксимуконат семиалдехид хидролазе да би се формирала 2-хидроксипент-2,4-диенска киселина. 2-хидроксипент-2,4-диеноат се затим претвара у пируват и ацеталдехид помоћу хидратазе (2-оксопент-4-еноат хидратазе) и алдолазе (4-хидрокси-2-оксопентаноат алдолазе), а затим улази у централни угљенични пут (Слика 3). Алтернативно, катехол се циклично цепа на цис,цис-муконат путем орто пута помоћу катехол 1,2-оксигеназе (C12DO). Муконат циклоизомераза, муконолактон изомераза и β-кетоадипат-нолактон хидролаза претварају цис,цис-муконат у 3-оксоадипат, који улази у централни угљенични пут преко сукцинил-КоА и ацетил-КоА (Nozaki et al., 1968) (Слика 3).
У гентизатном (2,5-дихидроксибензоатном) путу, ароматични прстен се цепа помоћу гентизат 1,2-диоксигеназе (GDO) да би се формирао малеилпируват. Овај производ се може директно хидролизовати у пируват и малат, или се може изомеризовати да би се формирао фумарилпируват, који се затим може хидролизовати у пируват и фумарат (Larkin and Day, 1986). Избор алтернативног пута је примећен и код грам-негативних и код грам-позитивних бактерија на биохемијском и генетском нивоу (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Грам-негативне бактерије (Pseudomonas) преферирају да користе салицилну киселину, која је индуктор метаболизма нафталена, декарбоксилујући је у катехол користећи салицилат 1-хидроксилазу (Gibson and Subramanian, 1984). С друге стране, код грам-позитивних бактерија (Rhodococcus), салицилат 5-хидроксилаза претвара салицилну киселину у гентизинску киселину, док салицилна киселина нема индуктивни ефекат на транскрипцију гена нафталена (Grund et al., 1992) (Слика 3).
Пријављено је да врсте као што су Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas и Mycobacterium могу разградити монометилнафтален или диметилнафтален (Dean-Raymond и Bartha, 1975; Cane и Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Међу њима, пут разградње 1-метилнафталена и 2-метилнафталена код Pseudomonas sp. CSV86 је јасно проучен на биохемијском и ензимском нивоу (Mahajan et al., 1994). 1-метилнафтален се метаболише путем два пута. Прво, ароматични прстен се хидроксилише (несупституисани прстен метилнафталена) да би се формирао цис-1,2-дихидрокси-1,2-дихидро-8-метилнафтален, који се даље оксидује до метил салицилата и метилкатехола, а затим улази у централни угљенични пут након цепања прстена (Слика 3). Овај пут се назива „пут извора угљеника“. У другом „путу детоксикације“, метил група може бити хидроксилована помоћу NDO да би се формирао 1-хидроксиметилнафтален, који се даље оксидује до 1-нафтојеве киселине и излучује у подлогу за култивацију као производ без коначног резултата. Студије су показале да сој CSV86 није у стању да расте на 1- и 2-нафтојевој киселини као једином извору угљеника и енергије, што потврђује његов пут детоксикације (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). У 2-метилнафталену, метил група се подвргава хидроксилацији помоћу хидроксилазе да би се формирао 2-хидроксиметилнафтален. Поред тога, несупституисани прстен нафталенског прстена подлеже хидроксилацији прстена да би се формирао дихидродиол, који се оксидује до 4-хидроксиметилкатехол у низу ензимски катализованих реакција и улази у централни угљенични пут преко пута цепања мета-прстена. Слично томе, објављено је да S. paucimobilis 2322 користи NDO за хидроксилацију 2-метилнафталена, који се даље оксидује да би се формирао метил салицилат и метилкатехол (Dutta et al., 1998).
Нафтојске киселине (супституисане/несупституисане) су нуспроизводи детоксификације/биотрансформације који настају током разградње метилнафталена, фенантрена и антрацена и ослобађају се у искоришћену подлогу за култивацију. Пријављено је да је изолат из земљишта, Stenotrophomonas maltophilia CSV89, способан да метаболише 1-нафтојску киселину као извор угљеника (Phale et al., 1995). Метаболизам почиње дихидроксилацијом ароматичног прстена да би се формирао 1,2-дихидрокси-8-карбоксинафтален. Добијени диол се оксидује до катехола путем 2-хидрокси-3-карбоксибензилиденпирувата, 3-формилсалицилне киселине, 2-хидроксиизофталне киселине и салицилне киселине и улази у централни угљенични пут преко пута цепања мета-прстена (Слика 3).
Карбарил је пестицид нафтил карбамата. Од Зелене револуције у Индији 1970-их, употреба хемијских ђубрива и пестицида довела је до повећања емисија полицикличних ароматичних угљоводоника (ПАХ) из пољопривредних дисперзних извора (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Процењује се да се 55% (85.722.000 хектара) укупног обрадивог земљишта у Индији третира хемијским пестицидима. Током последњих пет година (2015–2020), индијски пољопривредни сектор је у просеку користио 55.000 до 60.000 тона пестицида годишње (Одељење за задруге и добробит пољопривредника, Министарство пољопривреде, Влада Индије, август 2020). У северним и централним гангетским равницама (државама са највећом популацијом и густином насељености), употреба пестицида на усевима је широко распрострањена, а преовлађују инсектициди. Карбарил (1-нафтил-N-метилкарбамат) је карбаматни инсектицид широког спектра, умерено до високо токсичан, који се користи у индијској пољопривреди у просечној количини од 100–110 тона. Обично се продаје под трговачким називом Севин и користи се за сузбијање инсеката (лисних уши, ватрених мрава, бува, гриња, паука и многих других спољних штеточина) који погађају разне усеве (кукуруз, соју, памук, воће и поврће). Неки микроорганизми као што су Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus и Arthrobacter такође се могу користити за сузбијање других штеточина. Пријављено је да RC100 може разградити карбарил (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Пут разградње карбарила је опширно проучаван на биохемијским, ензимским и генетским нивоима у изолатима Pseudomonas sp. из земљишта, сојеви C4, C5 и C6 (Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Сл. 3). Метаболички пут почиње хидролизом естарске везе помоћу карбарил хидролазе (CH) да би се формирали 1-нафтол, метиламин и угљен-диоксид. 1-нафтол се затим претвара у 1,2-дихидроксинафтален помоћу 1-нафтол хидроксилазе (1-NH), који се даље метаболише путем централног угљеничног пута преко салицилата и гентизата. Пријављено је да неке бактерије које разграђују карбарил метаболишу нафтален у салицилну киселину путем цепања орто прстена катехола (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). Приметно је да бактерије које разграђују нафтален првенствено метаболишу салицилну киселину путем катехола, док бактерије које разграђују карбарил преферирају да метаболишу салицилну киселину путем гентизатног пута.
Деривати нафталенсулфонске киселине/дисулфонске киселине и нафтиламинсулфонске киселине могу се користити као међупроизводи у производњи азо боја, квасећих средстава, дисперзаната итд. Иако ова једињења имају ниску токсичност за људе, процене цитотоксичности су показале да су смртоносна за рибе, дафније и алге (Greim et al., 1994). Пријављено је да представници рода Pseudomonas (сојеви A3, C22) покрећу метаболизам двоструком хидроксилацијом ароматичног прстена који садржи групу сулфонске киселине да би се формирао дихидродиол, који се даље претвара у 1,2-дихидроксинафтален спонтаним цепањем сулфитне групе (Brilon et al., 1981). Добијени 1,2-дихидроксинафтален се катаболише класичним нафталенским путем, тј. катехолним или гентизатним путем (Слика 4). Показано је да аминонафталенсулфонска киселина и хидроксинафталенсулфонска киселина могу бити потпуно разграђене мешовитим бактеријским конзорцијумима са комплементарним катаболичким путевима (Nortemann et al., 1986). Показано је да један члан конзорцијума десулфуризује аминонафталенсулфонску киселину или хидроксинафталенсулфонску киселину 1,2-диоксигенацијом, док се аминосалицилат или хидроксисалицилат ослобађа у медијум за култивацију као метаболит који се не може наћи на позицији жртве и потом га апсорбују други чланови конзорцијума. Нафталендисулфонска киселина је релативно поларна, али слабо биоразградива и стога се може метаболисати различитим путевима. Прва десулфуризација се дешава током региоселективне дихидроксилације ароматичног прстена и групе сулфонске киселине; друга десулфуризација се дешава током хидроксилације 5-сулфосалицилне киселине помоћу салицилне киселине 5-хидроксилазе да би се формирала гентизинска киселина, која улази у централни угљенични пут (Brilon et al., 1981) (Слика 4). Ензими одговорни за разградњу нафталена такође су одговорни за метаболизам нафтален сулфоната (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Слика 4. Метаболички путеви за разградњу нафтален сулфоната. Бројеви унутар кругова представљају ензиме одговорне за метаболизам нафтил сулфоната, сличне/идентичне ензимима описаним на слици 3.
ПАХ мале молекулске тежине (НММ-ПАХ) су редуцибилни, хидрофобни и слабо растворљиви, те стога нису подложни природном разлагању/деградацији. Међутим, аеробни микроорганизми су у стању да их оксидују апсорбујући молекуларни кисеоник (О2). Ови ензими углавном припадају класи оксидоредуктаза и могу да изводе различите реакције као што су хидроксилација ароматичног прстена (моно- или дихидроксилација), дехидрогенација и цепање ароматичног прстена. Производи добијени овим реакцијама су у вишем оксидационом стању и лакше се метаболишу кроз централни угљенични пут (Phale et al., 2020). Пријављено је да су ензими у путу деградације индуцибилни. Активност ових ензима је веома ниска или занемарљива када се ћелије гаје на једноставним изворима угљеника као што су глукоза или органске киселине. Табела 3 сумира различите ензиме (оксигеназе, хидролазе, дехидрогеназе, оксидазе итд.) који учествују у метаболизму нафталена и његових деривата.
Табела 3. Биохемијске карактеристике ензима одговорних за разградњу нафталена и његових деривата.
Студије радиоизотопа (18O2) су показале да је уградња молекуларног O2 у ароматичне прстенове помоћу оксигеназа најважнији корак у активирању даље биоразградње једињења (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Уградња једног атома кисеоника (O) из молекуларног кисеоника (O2) у супстрат се иницира ендогеним или егзогеним монооксигеназама (такође названим хидроксилазама). Други атом кисеоника се редукује до воде. Егзогене монооксигеназе редукују флавин са NADH или NADPH, док се код ендомонооксигеназа флавин редукује супстратом. Положај хидроксилације резултира разноликошћу у формирању производа. На пример, салицилат 1-хидроксилаза хидроксилира салицилну киселину на C1 позицији, формирајући катехол. С друге стране, вишекомпонентна салицилат 5-хидроксилаза (која садржи подјединице редуктазе, фередоксина и оксигеназе) хидроксилише салицилну киселину на позицији C5, формирајући гентизинску киселину (Yamamoto et al., 1965).
Диоксигеназе уграђују два атома О2 у супстрат. У зависности од формираних производа, деле се на диоксигеназе које хидроксилују прстен и диоксигеназе које цепају прстен. Диоксигеназе које хидроксилују прстен претварају ароматичне супстрате у цис-дихидродиоле (нпр. нафтален) и широко су распрострањене међу бактеријама. До данас је показано да организми који садрже диоксигеназе које хидроксилују прстен могу да расту на различитим изворима ароматичног угљеника, а ови ензими су класификовани као NDO (нафтален), толуен диоксигеназа (TDO, толуен) и бифенил диоксигеназа (BPDO, бифенил). И NDO и BPDO могу катализовати двоструку оксидацију и хидроксилацију бочних ланаца различитих полицикличних ароматичних угљоводоника (толуен, нитротолуен, ксилен, етилбензен, нафтален, бифенил, флуорен, индол, метилнафтален, нафталенсулфонат, фенантрен, антрацен, ацетофенон, итд.) (Boyd and Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO је вишекомпонентни систем који се састоји од оксидоредуктазе, фередоксина и компоненте оксигеназе која садржи активно место (Gibson and Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Каталитичка јединица NDO састоји се од велике α подјединице и мале β подјединице распоређених у α3β3 конфигурацији. НДО припада великој породици оксигеназа, а његова α-подјединица садржи Рискеово место [2Fe-2S] и мононуклеарно нехемско гвожђе, што одређује специфичност супстрата НДО (Parales et al., 1998). Типично, у једном каталитичком циклусу, два електрона из редукције пиридин нуклеотида се преносе на Fe(II) јон у активном месту путем редуктазе, фередоксина и Рискеовог места. Редукциони еквиваленти активирају молекуларни кисеоник, што је предуслов за дихидроксилацију супстрата (Ferraro et al., 2005). До данас је само неколико НДО пречишћено и детаљно окарактерисано из различитих сојева, а генетска контрола путева укључених у разградњу нафталена је детаљно проучена (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Диоксигеназе које цепају прстен (ензими који цепају ендо- или орто-прстен и ензими који цепају егзодиол- или мета-прстен) делују на хидроксилована ароматична једињења. На пример, диоксигеназа која цепа орто-прстен је катехол-1,2-диоксигеназа, док је диоксигеназа која цепа мета-прстен катехол-2,3-диоксигеназа (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Поред различитих оксигеназа, постоје и различите дехидрогеназе одговорне за дехидрогенацију ароматичних дихидродиола, алкохола и алдехида и користећи NAD+/NADP+ као акцепторе електрона, који су неки од важних ензима укључених у метаболизам (Gibson and Subramanian, 1984; Shaw and Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Ензими као што су хидролазе (естеразе, амидазе) су друга важна класа ензима који користе воду за цепање ковалентних веза и показују широку специфичност супстрата. Карбарил хидролаза и друге хидролазе се сматрају компонентама периплазме (трансмембране) код чланова грам-негативних бактерија (Kamini et al., 2018). Карбарил има и амидну и естарску везу; стога, може се хидролизовати или естеразом или амидазом да би се формирао 1-нафтол. Пријављено је да карбарил у соју Rhizobium rhizobium AC10023 и соју Arthrobacter RC100 функционише као естераза и амидаза, респективно. Карбарил у соју Arthrobacter RC100 такође функционише као амидаза. Показано је да RC100 хидролизује четири инсектицида класе N-метилкарбамата као што су карбарил, метомил, мефенаминска киселина и XMC (Hayaatsu et al., 2001). Пријављено је да CH у Pseudomonas sp. C5pp може деловати на карбарил (100% активности) и 1-нафтил ацетат (36% активности), али не и на 1-нафтилацетатамид, што указује да је у питању естераза (Trivedi et al., 2016).
Биохемијске студије, обрасци регулације ензима и генетска анализа показале су да се гени за разградњу нафталена састоје од две индуцибилне регулаторне јединице или „оперона“: nah („узводни пут“, који претвара нафтален у салицилну киселину) и sal („низводни пут“, који претвара салицилну киселину у централни угљенични пут преко катехола). Салицилна киселина и њени аналози могу деловати као индуктори (Shamsuzzaman и Barnsley, 1974). У присуству глукозе или органских киселина, оперон је потиснут. Слика 5 приказује комплетну генетску организацију разградње нафталена (у облику оперона). Описано је неколико именованих варијанти/облика гена nah (ndo/pah/dox) и утврђено је да имају високу хомологију секвенци (90%) међу свим врстама Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Гени узводног пута нафталена су генерално распоређени консензусним редоследом као што је приказано на слици 5А. Још један ген, nahQ, такође је пријављен као укључен у метаболизам нафталена и обично се налазио између nahC и nahE, али његова стварна функција тек треба да се разјасни. Слично томе, ген nahY, одговоран за хемотаксију осетљиву на нафтален, пронађен је на дисталном крају nah оперона код неких чланова. Код Ralstonia sp., ген U2 који кодира глутатион S-трансферазу (gsh) налазио се између nahAa и nahAb, али није утицао на карактеристике коришћења нафталена (Zylstra et al., 1997).
Слика 5. Генетичка организација и разноликост примећене током разградње нафталена међу бактеријским врстама; (А) Горњи нафталенски пут, метаболизам нафталена до салицилне киселине; (Б) Доњи нафталенски пут, салицилна киселина преко катехола до централног угљеничног пута; (Ц) салицилна киселина преко гентизата до централног угљеничног пута.
„Доњи пут“ (сал оперон) се типично састоји од nahGTHINLMOKJ и претвара салицилат у пируват и ацеталдехид путем пута цепања катехол метаринга. Утврђено је да је ген nahG (који кодира салицилат хидроксилазу) конзервиран на проксималном крају оперона (Сл. 5Б). У поређењу са другим сојевима који разграђују нафтален, код P. putida CSV86 nah и sal оперони су тандемски и веома блиско повезани (око 7,5 kb). Код неких грам-негативних бактерија, као што су Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 и P. putida AK5, нафтален се метаболише као централни угљенични метаболит путем гентизатног пута (у облику sgp/nag оперона). Генска касета је типично представљена у облику nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, где се nagR (који кодира регулатор типа LysR) налази на горњем крају (слика 5C).
Карбарил улази у централни угљенични циклус путем метаболизма 1-нафтола, 1,2-дихидроксинафталена, салицилне киселине и гентизинске киселине (Слика 3). На основу генетских и метаболичких студија, предложено је да се овај пут подели на „узводни“ (конверзија карбарила у салицилну киселину), „средњи“ (конверзија салицилне киселине у гентизинску киселину) и „низводни“ (конверзија гентизинске киселине у интермедијере централног угљеничног пута) (Singh et al., 2013). Геномска анализа C5pp (суперконтиг А, 76,3 kb) открила је да је ген mcbACBDEF укључен у конверзију карбарила у салицилну киселину, затим mcbIJKL у конверзији салицилне киселине у гентизинску киселину, и mcbOQP у конверзији гентизинске киселине у централне угљеничне интермедијере (фумарат и пируват, Trivedi et al., 2016) (Слика 6).
Пријављено је да ензими укључени у разградњу ароматичних угљоводоника (укључујући нафтален и салицилну киселину) могу бити индуковани одговарајућим једињењима и инхибирани једноставним изворима угљеника као што су глукоза или органске киселине (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Међу различитим метаболичким путевима нафталена и његових деривата, регулаторне карактеристике нафталена и карбарила су донекле проучаване. За нафтален, гени и у узводним и низводним путевима регулисани су NahR, транс-активним позитивним регулатором типа LysR. Он је неопходан за индукцију nah гена салицилном киселином и његову накнадну експресију на високом нивоу (Yen and Gunsalus, 1982). Штавише, студије су показале да су интегративни фактор домаћина (IHF) и XylR (сигма 54-зависни транскрипциони регулатор) такође критични за транскрипциону активацију гена у метаболизму нафталена (Ramos et al., 1997). Студије су показале да се ензими пута отварања мета-прстена катехола, наиме катехол 2,3-диоксигеназа, индукују у присуству нафталена и/или салицилне киселине (Basu et al., 2006). Студије су показале да се ензими пута отварања орто-прстена катехола, наиме катехол 1,2-диоксигеназа, индукују у присуству бензоеве киселине и цис,цис-муконата (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Код соја C5pp, пет гена, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR и mcbS, кодирају регулаторе који припадају LysR/TetR фамилији транскрипционих регулатора одговорних за контролу разградње карбарила. Утврђено је да је хомологни ген mcbG најближе повезан са LysR-типским регулатором PhnS (58% идентитет аминокиселина) који је укључен у метаболизам фенантрена код Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Утврђено је да је ген mcbH укључен у средњи пут (конверзија салицилне киселине у гентизинску киселину) и припада LysR-типском транскрипционом регулатору NagR/DntR/NahR код Pseudomonas и Burkholderia. Пријављено је да чланови ове фамилије препознају салицилну киселину као специфичан ефекторски молекул за индукцију гена разградње. С друге стране, три гена, mcbN, mcbR и mcbS, који припадају транскрипционим регулаторима типа LysR и TetR, идентификовани су у низводном путу (метаболити гентизат-централног угљеничног пута).
Код прокариота, хоризонтални процеси преноса гена (аквизиција, размена или трансфер) путем плазмида, транспозона, профага, геномских острва и интегративних коњугативних елемената (ICE) су главни узроци пластичности у бактеријским геномима, што доводи до добијања или губитка специфичних функција/особина. То омогућава бактеријама да се брзо прилагоде различитим условима околине, пружајући потенцијалне адаптивне метаболичке предности домаћину, као што је разградња ароматичних једињења. Метаболичке промене се често постижу финим подешавањем оперона разградње, њихових регулаторних механизама и специфичности ензима, што олакшава разградњу ширег спектра ароматичних једињења (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Утврђено је да се генске касете за разградњу нафталена налазе на различитим мобилним елементима као што су плазмиди (коњугативни и некоњугативни), транспозони, геноми, ICE и комбинације различитих бактеријских врста (Слика 5). Код Pseudomonas G7, nah и sal оперони плазмида NAH7 су транскрибовани у истој оријентацији и део су дефектног транспозона коме је потребна транспозаза Tn4653 за мобилизацију (Sota et al., 2006). Код Pseudomonas соја NCIB9816-4, ген је пронађен на коњугативном плазмиду pDTG1 као два оперона (приближно 15 kb удаљена један од другог) који су транскрибовани у супротним смеровима (Dennis and Zylstra, 2004). Код Pseudomonas putida соја AK5, некоњугативни плазмид pAK5 кодира ензим одговоран за разградњу нафталена путем гентизатног пута (Izmalkova et al., 2013). Код Pseudomonas соја PMD-1, nah оперон се налази на хромозому, док се sal оперон налази на коњугативном плазмиду pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Међутим, код Pseudomonas stutzeri AN10, сви гени за разградњу нафталена (nah и sal оперони) налазе се на хромозому и вероватно се регрутују путем транспозиције, рекомбинације и преуређења (Bosch et al., 2000). Код Pseudomonas sp. CSV86, nah и sal оперони се налазе у геному у облику ICE (ICECSV86). Структура је заштићена са tRNAGly након чега следе директна понављања која указују на места рекомбинације/везивања (attR и attL) и фагу слична интеграза која се налази на оба краја tRNAGly, дакле структурно слична ICEclc елементу (ICEclcB13 код Pseudomonas knackmusii за разградњу хлорокатехола). Пријављено је да се гени на ICE могу пренети коњугацијом са изузетно ниском фреквенцијом преноса (10-8), чиме се својства разградње преносе на примаоца (Basu and Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Већина гена одговорних за разградњу карбарила налази се на плазмидима. Arthrobacter sp. RC100 садржи три плазмида (pRC1, pRC2 и pRC300) од којих два коњугативна плазмида, pRC1 и pRC2, кодирају ензиме који претварају карбарил у гентизат. С друге стране, ензими укључени у конверзију гентизата у централне угљеничне метаболите налазе се на хромозому (Hayaatsu et al., 1999). Бактерије рода Rhizobium. Сој AC100, који се користи за конверзију карбарила у 1-нафтол, садржи плазмид pAC200, који носи ген cehA који кодира CH као део Tnceh транспозона окруженог секвенцама сличним инсерционим елементима (istA и istB) (Hashimoto et al., 2002). Код соја Sphingomonas CF06, верује се да је ген за разградњу карбарила присутан у пет плазмида: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 и pCF05. ДНК хомологија ових плазмида је висока, што указује на постојање дупликације гена (Feng et al., 1997). Код симбионта који разграђује карбарил, састављеног од две врсте Pseudomonas, сој 50581 садржи коњугативни плазмид pCD1 (50 kb) који кодира ген за карбарил хидролазу mcd, док коњугативни плазмид код соја 50552 кодира ензим који разграђује 1-нафтол (Chapalamadugu и Chaudhry, 1991). Код соја Achromobacter WM111, ген за фурадан хидролазу mcd налази се на плазмиду од 100 kb (pPDL11). Показано је да је овај ген присутан на различитим плазмидима (100, 105, 115 или 124 kb) код различитих бактерија из различитих географских региона (Parekh et al., 1995). Код Pseudomonas sp. C5pp, сви гени одговорни за разградњу карбарила налазе се у геному који обухвата 76,3 kb секвенце (Trivedi et al., 2016). Анализа генома (6,15 Mb) открила је присуство 42 MGE и 36 GEI, од којих се 17 MGE налазило у суперконтигу A (76,3 kb) са просечним асиметричним садржајем G+C (54–60 mol%), што указује на могуће хоризонталне догађаје преноса гена (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 показује сличан распоред гена који разграђују карбарил, али ови гени се налазе на плазмиду (Zhu et al., 2019).
Поред метаболичке ефикасности на биохемијским и геномским нивоима, микроорганизми такође показују друга својства или реакције као што су хемотаксија, својства модификације ћелијске површине, компартментализација, преференцијално коришћење, производња биосурфактаната итд., што им помаже да ефикасније метаболишу ароматичне загађиваче у контаминираним срединама (слика 7).
Слика 7. Различите стратегије ћелијског одговора идеалних бактерија које разграђују ароматичне угљоводонике за ефикасну биоразградњу страних загађујућих једињења.
Хемотактички одговори се сматрају факторима који појачавају разградњу органских загађивача у хетерогено загађеним екосистемима. (2002) су показали да хемотаксија Pseudomonas sp. G7 на нафтален повећава брзину разградње нафталена у воденим системима. Дивљи тип соја G7 разграђује нафтален много брже од мутантног соја са недостатком хемотаксе. Утврђено је да је NahY протеин (538 аминокиселина са мембранском топологијом) котранскрибован са генима метаклеважног пута на NAH7 плазмиду, и попут хемотактичних трансдуктора, овај протеин изгледа функционише као хеморецептор за разградњу нафталена (Grimm and Harwood 1997). Још једна студија Хансела и др. (2009) показала је да је протеин хемотактичан, али је његова брзина разградње висока. (2011) су показали хемотактички одговор Pseudomonas (P. putida) на гасовити нафтален, где је дифузија у гасној фази резултирала сталним протоком нафталена у ћелије, што је контролисало хемотактички одговор ћелија. Истраживачи су искористили ово хемотактичко понашање да би створили микробе који би повећали брзину разградње. Студије су показале да хемосензорни путеви такође регулишу друге ћелијске функције као што су ћелијска деоба, регулација ћелијског циклуса и формирање биофилма, чиме помажу у контроли брзине разградње. Међутим, коришћење овог својства (хемотаксе) за ефикасну разградњу отежава неколико уских грла. Главне препреке су: (а) различити паралогни рецептори препознају иста једињења/лиганде; (б) постојање алтернативних рецептора, тј. енергетски тропизам; (ц) значајне разлике у секвенцама у сензорним доменима исте породице рецептора; и (д) недостатак информација о главним бактеријским сензорним протеинима (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Понекад, биоразградња ароматичних угљоводоника производи више метаболита/интермедијара, који могу бити хемотактични за једну групу бактерија, али одбојни за друге, што додатно компликује процес. Да бисмо идентификовали интеракције лиганда (ароматичних угљоводоника) са хемијским рецепторима, конструисали смо хибридне сензорске протеине (PcaY, McfR и NahY) спајањем сензорских и сигналних домена Pseudomonas putida и Escherichia coli, који циљају рецепторе за ароматичне киселине, TCA интермедијере и нафтален, респективно (Luu et al., 2019).
Под утицајем нафталена и других полицикличних ароматичних угљоводоника (ПАУ), структура бактеријске мембране и интегритет микроорганизама пролазе кроз значајне промене. Студије су показале да нафтален омета интеракцију ацилног ланца путем хидрофобних интеракција, чиме повећава отицање и флуидност мембране (Sikkema et al., 1995). Да би се супротставиле овом штетном ефекту, бактерије регулишу флуидност мембране променом односа и састава масних киселина између изо/антеизо масних киселина са разгранатим ланцем и изомеризацијом цис-незасићених масних киселина у одговарајуће транс-изомере (Heipieper and de Bont, 1994). Код Pseudomonas stutzeri узгајаних третманом нафталеном, однос засићених и незасићених масних киселина повећао се са 1,1 на 2,1, док се код Pseudomonas JS150 овај однос повећао са 7,5 на 12,0 (Mrozik et al., 2004). Када су гајене на нафталену, ћелије Achromobacter KAs 3–5 показале су агрегацију ћелија око кристала нафталена и смањење површинског наелектрисања ћелије (са -22,5 на -2,5 mV) праћено цитоплазматском кондензацијом и вакуолизацијом, што указује на промене у ћелијској структури и својствима ћелијске површине (Mohapatra et al., 2019). Иако су ћелијске/површинске промене директно повезане са бољим апсорпцијом ароматичних загађивача, релевантне биоинжењерске стратегије нису у потпуности оптимизоване. Манипулација обликом ћелија ретко је коришћена за оптимизацију биолошких процеса (Volke and Nikel, 2018). Брисање гена који утичу на ћелијску деобу изазива промене у ћелијској морфологији. Брисање гена који утичу на ћелијску деобу изазива промене у ћелијској морфологији. Код Bacillus subtilis, показано је да је протеин ћелијске септуме SepF укључен у формирање септума и да је неопходан за наредне кораке ћелијске деобе, али није есенцијални ген. Брисање гена који кодирају пептидне гликан хидролазе код Bacillus subtilis резултирало је издужењем ћелија, повећаном специфичном брзином раста и побољшаним капацитетом производње ензима (Cui et al., 2018).
Предложена је компартментализација пута разградње карбарила како би се постигла ефикасна разградња сојева Pseudomonas C5pp и C7 (Kamini et al., 2018). Претпоставља се да се карбарил транспортује у периплазматски простор кроз спољашњу мембранску септуму и/или кроз дифузибилне порине. CH је периплазматски ензим који катализује хидролизу карбарила до 1-нафтола, који је стабилнији, хидрофобнији и токсичнији. CH је локализован у периплазми и има низак афинитет за карбарил, чиме контролише формирање 1-нафтола, чиме спречава његово накупљање у ћелијама и смањује његову токсичност за ћелије (Kamini et al., 2018). Добијени 1-нафтол се транспортује у цитоплазму преко унутрашње мембране партиционисањем и/или дифузијом, а затим се хидроксилише до 1,2-дихидроксинафталена помоћу ензима 1NH високог афинитета за даљи метаболизам у централном угљеничном путу.
Иако микроорганизми имају генетске и метаболичке способности да разграде ксенобиотске изворе угљеника, хијерархијска структура њиховог коришћења (тј. преференцијална употреба једноставних у односу на сложене изворе угљеника) представља главну препреку биоразградњи. Присуство и коришћење једноставних извора угљеника смањује регулацију гена који кодирају ензиме који разграђују сложене/непреференцијалне изворе угљеника као што су ПАХ. Добро проучен пример је да када се глукоза и лактоза истовремено дају Escherichia coli, глукоза се ефикасније користи од лактозе (Jacob and Monod, 1965). Пријављено је да Pseudomonas разграђује разне ПАХ и ксенобиотска једињења као изворе угљеника. Хијерархија коришћења извора угљеника код Pseudomonas је органске киселине > глукоза > ароматична једињења (Hylemon and Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Међутим, постоји изузетак. Занимљиво је да Pseudomonas sp. CSV86 показује јединствену хијерархијску структуру која преференцијално користи ароматичне угљоводонике (бензоеву киселину, нафтален, итд.) уместо глукозе и кометаболише ароматичне угљоводонике са органским киселинама (Basu et al., 2006). Код ове бактерије, гени за разградњу и транспорт ароматичних угљоводоника нису смањени чак ни у присуству другог извора угљеника као што су глукоза или органске киселине. Када се гаји у медијуму са глукозом и ароматичним угљоводоницима, примећено је да су гени за транспорт и метаболизам глукозе смањени, ароматични угљоводоници су коришћени у првој лог фази, а глукоза је коришћена у другој лог фази (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). С друге стране, присуство органских киселина није утицало на експресију метаболизма ароматичних угљоводоника, па се очекује да ће ова бактерија бити кандидатски сој за студије биоразградње (Phale et al., 2020).
Добро је познато да биотрансформација угљоводоника може изазвати оксидативни стрес и повећање антиоксидативних ензима код микроорганизама. Неефикасна биоразградња нафталена, како у ћелијама стационарне фазе, тако и у присуству токсичних једињења, доводи до формирања реактивних врста кисеоника (ROS) (Kang et al. 2006). Пошто ензими који разграђују нафтален садрже кластере гвожђа и сумпора, под оксидативним стресом, гвожђе у хему и протеинима гвожђа и сумпора ће бити оксидовано, што доводи до инактивације протеина. Фередоксин-NADP+ редуктаза (Fpr), заједно са супероксид дисмутазом (SOD), посредује у реверзибилној редокс реакцији између NADP+/NADPH и два молекула фередоксина или флаводоксина, чиме се уклања ROS и обнавља центар гвожђа и сумпора под оксидативним стресом (Li et al. 2006). Пријављено је да и Fpr и SodA (SOD) код Pseudomonas могу бити индуковани оксидативним стресом, а повећана активност SOD и каталазе је примећена код четири соја Pseudomonas (O1, W1, As1 и G1) током раста у условима додатка нафталена (Kang et al., 2006). Студије су показале да додавање антиоксиданата као што су аскорбинска киселина или гвожђе (Fe2+) може повећати брзину раста нафталена. Када је Rhodococcus erythropolis растао у нафталенској подлози, транскрипција гена цитохрома P450 повезаних са оксидативним стресом, укључујући sodA (Fe/Mn супероксид дисмутаза), sodC (Cu/Zn супероксид дисмутаза) и recA, била је повећана (Sazykin et al., 2019). Компаративна квантитативна протеомска анализа ћелија Pseudomonas култивисаних у нафталину показала је да је повећана регулација различитих протеина повезаних са одговором на оксидативни стрес стратегија суочавања са стресом (Herbst et al., 2013).
Пријављено је да микроорганизми производе биосурфактанте под дејством хидрофобних извора угљеника. Ови сурфактанти су амфифилна површински активна једињења која могу формирати агрегате на границама уље-вода или ваздух-вода. Ово подстиче псеудо-солубилизацију и олакшава адсорпцију ароматичних угљоводоника, што резултира ефикасном биоразградњом (Rahman et al., 2002). Због ових својстава, биосурфактанти се широко користе у разним индустријама. Додавање хемијских сурфактаната или биосурфактаната бактеријским културама може побољшати ефикасност и брзину разградње угљоводоника. Међу биосурфактантима, рамнолипиди које производи Pseudomonas aeruginosa су опширно проучавани и окарактерисани (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Поред тога, друге врсте биосурфактаната укључују липопептиде (муцине из Pseudomonas fluorescens), емулгатор 378 (из Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg и Ron, 1999), трехалоза дисахаридне липиде из Rhodococcus (Ramdahl, 1985), лихенин из Bacillus (Saraswathy и Hallberg, 2002) и сурфактант из Bacillus subtilis (Siegmund и Wagner, 1991) и Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Показано је да ови снажни сурфактанти смањују површински напон са 72 дин/цм на мање од 30 дин/цм, омогућавајући бољу апсорпцију угљоводоника. Пријављено је да Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia и друге бактеријске врсте могу да производе различите биосурфактанте на бази рамнолипида и гликолипида када се гаје у медијумима нафталена и метилнафталена (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 може да произведе екстрацелуларни биосурфактант Biosur-Pm када се гаји на ароматичним једињењима као што је нафтојева киселина (Phale et al., 1995). Кинетика формирања Biosur-Pm показала је да је његова синтеза процес зависан од раста и pH вредности. Утврђено је да је количина Biosur-Pm коју производе ћелије при неутралном pH била већа него при pH 8,5. Ћелије гајене при pH 8,5 биле су хидрофобније и имале су већи афинитет за ароматична и алифатична једињења него ћелије гајене при pH 7,0. Код Rhodococcus spp. N6, већи однос угљеника и азота (C:N) и ограничење гвожђа су оптимални услови за производњу екстрацелуларних биосурфактаната (Mutalik et al., 2008). Урађени су покушаји да се побољша биосинтеза биосурфактаната (сурфактина) оптимизацијом сојева и ферментације. Међутим, титар сурфактаната у медијуму за култивацију је низак (1,0 g/L), што представља изазов за производњу великих размера (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Стога су коришћене методе генетског инжењеринга за побољшање његове биосинтезе. Међутим, његова инжењерска модификација је тешка због велике величине оперона (∼25 kb) и сложене биосинтетске регулације система кворум сензора (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Низ генетских модификација је спроведен код бактерија Bacillus, углавном усмерених на повећање производње сурфактина заменом промотора (srfA оперона), прекомерном експресијом протеина за извоз сурфактина YerP и регулаторних фактора ComX и PhrC (Jiao et al., 2017). Међутим, ове методе генетског инжењеринга су постигле само једну или неколико генетских модификација и још увек нису достигле комерцијалну производњу. Стога је неопходно даље проучавање метода оптимизације заснованих на знању.
Студије биоразградње PAH се углавном спроводе у стандардним лабораторијским условима. Међутим, на контаминираним локацијама или у контаминираним срединама, показало се да многи абиотски и биотски фактори (температура, pH, кисеоник, доступност хранљивих материја, биорасположивост супстрата, други ксенобиотици, инхибиција крајњег производа итд.) мењају и утичу на разградни капацитет микроорганизама.
Температура има значајан утицај на биоразградњу PAH. Како температура расте, концентрација раствореног кисеоника се смањује, што утиче на метаболизам аеробних микроорганизама, јер им је потребан молекуларни кисеоник као један од супстрата за оксигеназе које спроводе реакције хидроксилације или цепања прстена. Често се примећује да повишена температура претвара матичне PAH у токсичнија једињења, чиме инхибира биоразградњу (Muller et al., 1998).
Примећено је да многа места контаминирана PAH имају екстремне pH вредности, као што су места контаминирана дренажом киселих рудника (pH 1–4) и места гасификације природног гаса/угља контаминирана алкалним процедним водама (pH 8–12). Ови услови могу озбиљно утицати на процес биоразградње. Стога, пре употребе микроорганизама за биоремедијацију, препоручује се подешавање pH вредности додавањем одговарајућих хемикалија (са умереним до веома ниским оксидационо-редукционим потенцијалом) као што су амонијум сулфат или амонијум нитрат за алкална земљишта или калцијум карбонат или магнезијум карбонат за кисела места (Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020).
Снабдевање кисеоником погођеног подручја је фактор који ограничава брзину биоразградње PAH. Због редокс услова животне средине, процеси биоремедијације in situ обично захтевају уношење кисеоника из спољашњих извора (обрада, пропумпивање ваздухом и додавање хемикалија) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) су показали да додавање магнезијум пероксида (једињења које ослобађа кисеоник) у контаминирани водоносни слој може ефикасно биоремедијатирати BTEX једињења. Друга студија је истраживала in situ разградњу фенола и BTEX у контаминираном водоносном слоју убризгавањем натријум нитрата и изградњом бунара за екстракцију како би се постигла ефикасна биоремедијација (Bewley and Webb, 2001).