Тренутна *Тренутна адреса: Келн 50931, Немачка, Келнски кластер изврсности за истраживање ћелијског стресног одговора код болести повезаних са старењем (CECAD).
Неуродегенерација митохондријалних болести се сматра неповратном јер је метаболичка пластичност неурона ограничена, али је ефекат митохондријалне дисфункције на ћелијску аутономију неуронског метаболизма у телу слабо схваћен. Овде представљамо ћелијски специфичан протеом Пуркињеових неурона са прогресивним недостатком OXPHOS-а изазваним поремећеном динамиком митохондријалне фузије. Открили смо да је митохондријална дисфункција покренула дубоку промену у области протеомике, што је на крају довело до секвенцијалне активације прецизних метаболичких програма пре ћелијске смрти. Неочекивано, утврдили смо очигледну индукцију пируват карбоксилазе (PCx) и других ензима против старења који допуњују интермедијере TCA циклуса. Инхибиција PCx погоршала је оксидативни стрес и неуродегенерацију, што указује да атеросклероза има заштитни ефекат код неурона којима недостаје OXPHOS. Рестаурација митохондријалне фузије у терминално дегенерисаним неуронима потпуно преокреће ове метаболичке карактеристике, чиме се спречава ћелијска смрт. Наши налази идентификују раније непознате путеве који дају отпорност митохондријалној дисфункцији и показују да се неуродегенерација може преокренути чак и у каснијим фазама болести.
Централна улога митохондрија у одржавању неуронског енергетског метаболизма наглашена је опсежним неуролошким симптомима повезаним са људским митохондријалним болестима. Већину ових болести узрокују генске мутације које регулишу експресију митохондријалних гена (1, 2) или уништавање гена повезано са митохондријалном динамиком, што индиректно утиче на стабилност митохондријалне ДНК (мтДНК) (3, 4). Рад на животињским моделима показао је да се као одговор на митохондријалну дисфункцију у околним ткивима могу активирати конзервативни метаболички путеви (5-7), што пружа важне информације за дубинско разумевање патогенезе ових сложених болести. Насупрот томе, наше разумевање метаболичких промена специфичних типова ћелија изазваних општим неуспехом производње митохондријалног аденозин трифосфата (АТП) у мозгу је фундаментално (8), наглашавајући потребу за идентификацијом терапеутских циљева који се могу користити за спречавање или превенцију болести. Спречити неуродегенерацију (9). Недостатак информација је чињеница да се нервне ћелије широко сматрају веома ограниченом метаболичком флексибилношћу у поређењу са типовима ћелија околних ткива (10). С обзиром на то да ове ћелије играју централну улогу у координацији снабдевања метаболита неуронима како би се подстакла синаптичка трансмисија и одговорило на повреде и болести, способност прилагођавања ћелијског метаболизма изазовним условима можданог ткива готово је ограничена на глијалне ћелије (11-14). Поред тога, инхерентна ћелијска хетерогеност можданог ткива у великој мери отежава проучавање метаболичких промена које се јављају у специфичним неуронским подгрупама. Као резултат тога, мало се зна о тачним ћелијским и метаболичким последицама митохондријалне дисфункције у неуронима.
Да бисмо разумели метаболичке последице митохондријалне дисфункције, изоловали смо Пуркињеове неуроне (ПН) у различитим фазама неуродегенерације изазване уништењем фузије спољашње мембране митохондрија (Mfn2). Иако су мутације Mfn2 код људи повезане са обликом наследне моторно-сензорне неуропатије познате као Шарко-Мари-Тут тип 2А (15), условно уништење Mfn2 код мишева је добро позната метода индукције оксидационо-фосфорилационе (OXPHOS) дисфункције. Различити неуронски подтипови (16-19) и резултујући неуродегенеративни фенотип праћени су прогресивним неуролошким симптомима, као што су поремећаји покрета (18, 19) или церебеларна атаксија (16). Користећи комбинацију квантитативне (LFQ) протеомике без обележавања, метаболомике, метода снимања и вирусолошких метода, показујемо да прогресивна неуродегенерација снажно индукује пируват карбоксилазу (PCx) и друге факторе укључене у артериосклерозу ПН in vivo. Експресија ензима. Да бисмо потврдили релевантност овог налаза, посебно смо смањили експресију PCx код ћелијских неуралгија са недостатком Mfn2 и открили да ова операција погоршава оксидативни стрес и убрзава неуродегенерацију, чиме доказујемо да азооспермија доводи до ћелијске смрти и метаболичке прилагодљивости. Тешка експресија MFN2 може потпуно спасити терминалну дегенеративну неуралгију са тешким недостатком OXPHOS, масивном потрошњом митохондријалне ДНК и очигледно оштећеном митохондријалном мрежом, што додатно наглашава да се овај облик неуродегенерације може опоравити чак и у узнапредовалом стадијуму болести пре ћелијске смрти.
Да бисмо визуализовали митохондрије у ПН са Mfn2 нокаутом, користили смо сој мишева који омогућава митохондријама зависним од Cre да циљају експресију жутог флуоресцентног протеина (YFP) (mtYFP) (20) Cre и проверили смо морфологију митохондрија in vivo. Открили смо да уништавање Mfn2 гена у ПН доводи до постепене поделе митохондријалне мреже (слика S1A), а најранија промена је примећена у 3 недеље старости. Насупрот томе, значајна дегенерација слоја ПН ћелија, што је доказано губитком имунобојења калбиндином, није почела до 12 недеља старости (слика 1, А и Б). Временска неусклађеност између најранијих промена у морфологији митохондрија и видљивог почетка неуронске смрти подстакла нас је да истражимо метаболичке промене изазване митохондријалном дисфункцијом пре ћелијске смрти. Развили смо стратегију засновану на сортирању ћелија активираних флуоресценцијом (FACS) за изолацију PN које експресују YFP (YFP+) (Слика 1C), и код контролних мишева (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), у даљем тексту CTRL (Слика S1B). Оптимизација стратегије гејтинга заснована на релативном интензитету YFP сигнала омогућава нам да пречистимо YFP+ тело (YFPhigh) PN од не-PN (YFPneg) (Слика S1B) или претпостављених флуоресцентних аксонских/дендритичних фрагмената (YFPlow; Слика S1D, лево), што је потврђено конфокалним микроскопом (Слика S1D, десно). Да бисмо проверили идентитет класификоване популације, спровели смо LFQ протеомику, а затим анализу главних компоненти и открили да постоји јасна разлика између YFPhigh и YFPneg ћелија (Слика S1C). YFPhigh ћелије су показале нето обогаћивање познатим PN маркерима (нпр. Calb1, Pcp2, Grid2 и Itpr3) (21, 22), али не и обогаћивање протеинима који се обично експресују у неуронима или другим типовима ћелија (Слика 1D). Поређење између узорака у класификованим YFPhigh ћелијама прикупљеним у независним експериментима показало је коефицијент корелације > 0,9, што показује добру репродуктивност између биолошких репликата (Слика S1E). Укратко, ови подаци су потврдили наш план за акутну и специфичну изолацију изводљивих PN. Пошто коришћени L7-cre драјверски систем индукује мозаичну рекомбинацију у првој недељи након порођаја (23), почели смо да излучујемо мишеве из CTRL и условно (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) сакупљамо неуроне. Након што је рекомбинација завршена, назива се Mfn2cKO у старости од 4 недеље. Као крајњу тачку, изабрали смо 8 недеља старости када је ПН слој био нетакнут упркос очигледној фрагментацији митохондрија (Слика 1Б и Слика С1А). Укупно смо квантификовали укупно 3013 протеина, од којих је око 22% засновано на MitoCarta 2.0 анотацијама на основу митохондријалног протеома као митохондрије (Слика 1Е) (Слика 1Е) (24). Анализа диференцијалне експресије гена извршена у 8. недељи показала је да је само 10,5% свих протеина имало значајне промене (Слика 1Ф и Слика С1Ф), од којих је 195 протеина било смањено, а 120 протеина повећано (Слика 1Ф). Вреди напоменути да „иновативна анализа путање“ овог скупа података показује да диференцијално експримирани гени углавном припадају ограниченом скупу специфичних метаболичких путева (Слика 1Г). Занимљиво је да, иако смањење регулације путева повезаних са OXPHOS и калцијумском сигнализацијом потврђује индукцију митохондријалне дисфункције код ПН са недостатком фузије, друге категорије које углавном укључују метаболизам аминокиселина су значајно појачане, што је у складу са метаболизмом који се јавља код митохондријалних ПН. Ревиринг је конзистентни. дисфункција.
(А) Репрезентативне конфокалне фотографије церебеларних пресека CTRL и Mfn2cKO мишева које показују прогресиван губитак ПН (калбиндин, сиво); језгра су контрастно обојена са DAPI. (Б) Квантификација (А) (једносмерна анализа варијансе, ***P<0,001; n = 4 до 6 кругова од три миша). (Ц) Експериментални ток рада. (Д) Дистрибуција топлотне мапе маркера специфичних за Пуркиње (горе) и друге типове ћелија (средина). (Е) Венов дијаграм који приказује број митохондријалних протеина идентификованих у класификованој ПН. (Ф) Вулкански графикон диференцијално експримираних протеина у Mfn2cKO неуронима након 8 недеља (гранична вредност значајности од 1,3). (Г) Анализа креативних путања показује пет најважнијих путева повећања (црвена) и смањења (плава) у Mfn2cKO ПН класификованој као 8 недеља. Приказан је просечан ниво експресије сваког детектованог протеина. Топлотна мапа у сивим тоновима: прилагођена P вредност. ns, није важно.
Протеомички подаци су показали да се експресија протеина комплекса I, III и IV постепено смањује. Комплекси I, III и IV су садржали есенцијалне подјединице кодиране мтДНК, док је комплекс II, који је био само нуклеарно кодиран, у основи остао непромењен (Слика 2А и Слика S2А). У складу са протеомским резултатима, имунохистохемија пресека церебеларног ткива показала је да се ниво подјединице MTCO1 (подјединица 1 митохондријалног цитохрома Ц оксидазе) комплекса IV у периферној неутрофили (ПН) постепено смањује (Слика 2Б). Подјединица Mtatp8 кодирана мтДНК је значајно смањена (Слика S2А), док је ниво стабилног стања подјединице АТП синтазе кодиране нуклеарно остао непромењен, што је у складу са познатим стабилним комплексом подсклопа АТП синтазе F1 када је експресија мтДНК стабилна. Формирање је конзистентно. Прекид (7). Евалуација нивоа мтДНК у сортираним Mfn2cKO ПН помоћу ланчане реакције полимеразе у реалном времену (qPCR) потврдила је постепено смањење броја копија мтДНК. У поређењу са контролном групом, у 8 недеља старости, задржано је само око 20% нивоа мтДНК (Слика 2Ц). У складу са овим резултатима, конфокално микроскопско бојење Mfn2cKO PN је коришћено за детекцију ДНК, показујући временски зависну потрошњу митохондријалних нуклеотида (Слика 2Д). Открили смо да су само неки кандидати укључени у разградњу митохондријалних протеина и одговор на стрес били појачано регулисани, укључујући Lonp1, Afg3l2 и Clpx, и факторе склапања OXPHOS комплекса. Нису откривене значајне промене у нивоима протеина укључених у апоптозу (Слика С2Б). Слично томе, открили смо да канали митохондрија и ендоплазматског ретикулума укључени у транспорт калцијума имају само мање промене (Слика С2Ц). Поред тога, евалуација протеина повезаних са аутофагијом није пронашла значајне промене, што је у складу са видљивом индукцијом аутофагозома примећеном in vivo имунохистохемијом и електронском микроскопијом (Слика С3). Међутим, прогресивна OXPHOS дисфункција код PN је праћена очигледним ултраструктурним митохондријалним променама. Митохондријални кластери се могу видети у ћелијским телима и дендритским стаблима Mfn2cKO PN старих 5 и 8 недеља, а структура унутрашње мембране је претрпела значајне промене (слике S4, A и B). У складу са овим ултраструктурним променама и значајним смањењем mtDNA, анализа акутних церебеларних резова са тетраметилродамин метил естром (TMRM) показала је да је потенцијал митохондријалне мембране код Mfn2cKO PN значајно смањен (слика S4C).
(А) Анализа временског тока нивоа експресије OXPHOS комплекса. Узмите у обзир само протеине са P<0,05 након 8 недеља (двосмерна ANOVA). Испрекидана линија: Без прилагођавања у поређењу са CTRL. (Б) Лево: Пример церебеларног пресека обележеног анти-MTCO1 антителом (скала, 20 μm). Површина коју заузимају Пуркиње ћелијски тели је покривена жутом бојом. Десно: Квантификација нивоа MTCO1 (једносмерна анализа варијансе; n = 7 до 20 ћелија анализираних од три миша). (Ц) qPCR анализа броја копија mtDNA у сортираној PN (једносмерна анализа варијансе; n = 3 до 7 мишева). (Д) Лево: Пример церебеларног пресека обележеног анти-DNA антителом (скала, 20 μm). Површина коју заузимају Пуркиње ћелијски тели је покривена жутом бојом. Десно: Квантификација лезија mtDNA (једносмерна анализа варијансе; n = 5 до 9 ћелија од три миша). (Е) Пример акутног церебеларног пресека који приказује mitoYFP + Пуркињеове ћелије (стрелица) у снимку целе ћелије помоћу патч клемпа. (Ф) Квантификација IV криве. (Г) Репрезентативни снимци убризгавања деполаризујуће струје у CTRL и Mfn2cKO Пуркињеове ћелије. Горњи траг: Први импулс који је покренуо АП. Доњи траг: Максимална АП фреквенција. (Х) Квантификација постсинаптичких спонтаних улаза (сПСП). Репрезентативни траг снимања и његов однос зумирања приказани су у (И). Једносмерна анализа варијансе анализирала је n = 5 до 20 ћелија од три миша. Подаци су изражени као средња вредност ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (Ј) Репрезентативни трагови спонтане АП снимљене коришћењем перфорираног патч клемпа режима. Горњи траг: Максимална АП фреквенција. Доњи траг: зумирање једне АП. (К) Квантификујте просечну и максималну АП фреквенцију према (Ј). Ман-Витнијев тест; n = 5 ћелија је анализирано од четири миша. Подаци су изражени као средња вредност ± SEM; није важно.
Очигледно оштећење OXPHOS-а је откривено код 8 недеља старе Mfn2cKO PN, што указује да је физиолошка функција неурона озбиљно абнормална. Стога смо анализирали пасивне електричне карактеристике неурона са недостатком OXPHOS-а у 4 до 5 недеља и 7 до 8 недеља извођењем снимака целокупних ћелија помоћу патч клемп технологије у акутним церебеларним пресецима (Слика 2Е). Неочекивано, просечан мембрански потенцијал у мировању и улазни отпор Mfn2cKO неурона били су слични контролној групи, иако је било суптилних разлика између ћелија (Табела 1). Слично томе, у 4 до 5 недеља старости нису пронађене значајне промене у односу струје и напона (IV крива) (Слика 2Ф). Међутим, ниједан Mfn2cKO неурон стар 7 до 8 недеља није преживео IV режим (корак хиперполаризације), што указује да постоји јасна осетљивост на потенцијал хиперполаризације у овој касној фази. Насупрот томе, код Mfn2cKO неурона, деполаризујуће струје које изазивају понављајућа пражњења акционог потенцијала (AP) су добро толерисане, што указује да се њихови укупни обрасци пражњења не разликују значајно од оних код контролних неурона старих 8 недеља (Табела 1 и Слика 2G). Слично томе, фреквенција и амплитуда спонтаних постсинаптичких струја (sPSC) биле су упоредиве са онима код контролне групе, а учесталост догађаја се повећала са 4 недеље на 5 недеља на 7 недеља на 8 недеља са сличним повећањем (Слика 2, H и I). Период синаптичког сазревања код PN (25). Слични резултати су добијени након перфорираних PN закрпа. Ова конфигурација спречава могућу компензацију ћелијских АТП дефекта, као што би се могло догодити код снимања закрпама целих ћелија. Конкретно, потенцијал мембране у мировању и фреквенција спонтаног паљења Mfn2cKO неурона нису били погођени (Слика 2, J и K). Укратко, ови резултати указују да се PN са очигледном OXPHOS дисфункцијом могу добро носити са високофреквентним обрасцима пражњења, што указује да постоји механизам компензације који им омогућава да одрже скоро нормалне електрофизиолошке одговоре.
Подаци су изражени као средња вредност ± SEM (једнофакторска анализа варијансе, Холм-Сидаков тест вишеструког поређења; *P<0,05). Број јединице је означен заградама.
Кренули смо да истражимо да ли било која категорија у протеомском скупу података (слика 1Г) укључује путеве који могу да се супротставе тешком недостатку OXPHOS-а, чиме се објашњава зашто погођена периферна нервна ћелија може да одржи скоро нормалну електрофизиологију (слика 2, од Е до К). Протеомска анализа је показала да су ензими укључени у катаболизам аминокиселина разгранатог ланца (BCAA) значајно повећани (слика 3А и слика С5А), а коначни производ ацетил-CoA (CoA) или сукцинил CoA могу да допуне трикарбоксилате у циклусу артериосклерозне киселине (TCA). Открили смо да се садржај BCAA трансаминазе 1 (BCAT1) и BCAT2 повећао. Оне катализују први корак катаболизма BCAA стварањем глутамата из α-кетоглутарата (26). Све подјединице које чине комплекс кето киселинске дехидрогеназе разгранатог ланца (BCKD) су повећане (комплекс катализује накнадну и неповратну декарбоксилацију резултујућег угљеничног скелета BCAA) (слика 3А и слика С5А). Међутим, нису пронађене очигледне промене у самом BCAA у сортираној PN, што може бити последица повећаног ћелијског уноса ових есенцијалних аминокиселина или употребе других извора (глукозе или млечне киселине) за допуну TCA циклуса (Слика S5B). PN којима недостаје OXPHOS такође су показале повећану активност разградње глутамина и трансаминације у старости од 8 недеља, што се може одразити повећаном регулацијом митохондријалних ензима глутаминазе (GLS) и глутамин пируват трансаминазе 2 (GPT2) (Слика 3, A и C). Вреди напоменути да је повећана регулација GLS ограничена на сплајсовану изоформу глутаминазе C (GLS-GAC) (промена Mfn2cKO/CTRL је приближно 4,5 пута већа, P = 0,05), а њена специфична повећана регулација у ткивима рака може подржати митохондријалну биоенергију. (27).
(А) Топлотна мапа приказује промену нивоа протеина за наведени пут након 8 недеља. (Б) Пример церебеларног пресека обележеног анти-PCx антителом (скала, 20 μм). Жута стрелица показује на тело Пуркињеових ћелија. (Ц) Анализа временског тока експресије протеина идентификована као важан кандидат за атеросклерозу (вишеструки t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 мишева). (Д) Горе: Шематски дијаграм који приказује различите начине уноса обележеног угљеника садржаног у трасеру [1-13C]пируват (тј. путем PDH или трансартеријског пута). Доле: Графикон виолине приказује проценат једноструко обележеног угљеника (M1) претвореног у аспарагинску киселину, лимунску киселину и јабучну киселину након обележавања акутних церебеларних пресека са [1-13C]пируватом (упарени t-тест; ** P <0,01). (Е) Свеобухватна анализа временског тока назначеног пута. Узмите у обзир само протеине са P <0,05 након 8 недеља. Испрекидана линија: нема вредности корекције (двосмерна анализа варијансе; * P <0,05; *** P <0,001). Подаци су изражени као средња вредност ± SEM.
У нашој анализи, катаболизам BCAA је постао један од кључних путева повећања експресије. Ова чињеница снажно указује на то да се запремина вентилације која улази у TCA циклус може променити код периферних ћелија којима недостаје OXPHOS. Ово може представљати главни облик неуронског метаболичког пренавођења, што може имати директан утицај на неуронску физиологију и преживљавање током одржавања тешке OXPHOS дисфункције. У складу са овом хипотезом, открили смо да је главни антиатеросклеротски ензим PCx повећано регулисан (Mfn2cKO/CTRL се мења приближно 1,5 пута; Слика 3А), што катализује конверзију пирувата у оксалоацетат (28), за који се верује да се налази у можданом ткиву. Експресија је ограничена на астроците (29, 30). У складу са резултатима протеомике, конфокална микроскопија је показала да је експресија PCx специфично и значајно повећана код периферних ћелија којима недостаје OXPHOS, док је реактивност PCx углавном ограничена на суседне Бергманове глијалне ћелије контролне групе (Слика 3Б). Да бисмо функционално тестирали примећену појачану регулацију PCx, третирали смо акутне церебеларне кришке са [1-13C]пируват трасером. Када је пируват оксидован пируват дехидрогеназом (PDH), његова изотопска ознака је нестала, али се уграђује у интермедијере TCA циклуса када се пируват метаболише васкуларним реакцијама (Слика 3D). Као потпору нашим протеомским подацима, приметили смо велики број маркера из овог трасера ​​у аспарагинском киселом кришкама Mfn2cKO, док су лимунска и јабучна киселина такође имале умерен тренд, иако не значајан (Слика 3D).
У допаминским неуронима мишева MitoPark са митохондријалном дисфункцијом изазваном допаминским неуронима који специфично уништавају ген митохондријалног транскрипционог фактора А (Tfam) (слика S6B), експресија PCx је такође била значајно повећана (31), што указује да је ацетонска киселинска артериосклероза регулисана током дисфункције неуронског OXPHOS у телу. Вреди напоменути да је откривено да су јединствени ензими (32-34) који се могу експресовати у неуронима који могу бити повезани са артериосклерозом значајно повећани у PN којима недостаје OXPHOS, као што су пропионил-CoA карбоксилаза (PCC-A), малонил-CoA претвара пропионил-CoA у сукцинил-CoA и митохондријални јабучни ензим 3 (ME3), чија је главна улога да поврати пируват из малата (слика 3, A и C) (33, 35). Поред тога, пронашли смо значајно повећање ензима Pdk3, који фосфорилује и тиме инактивира PDH (36), док нису откривене никакве промене у ензиму Pdp1 који активира PDH или самом комплексу ензима PDH (Слика 3А). Сходно томе, код Mern2cKO PN, фосфорилација α1 подјединице α (PDHE1α) подјединице пируват дехидрогеназе E1 компоненте PDH комплекса у Ser293 (познато да инхибира ензимску активност PDH) била је појачана (Слика S6C) (Слика S6C). Пируват нема васкуларни приступ.
Коначно, открили смо да су суперпут биосинтезе серина и глицина, повезани митохондријални фолни (1C) циклус и биосинтеза пролина (слика 1G и слика S5C) значајно повећани, према извештајима, током процеса активације. Околна ткива су активирана са митохондријалном дисфункцијом (5-7). Конфокална анализа која подржава ове протеомске податке показала је да су код PN са недостатком OXPHOS, церебеларни резови мишева старих 8 недеља били подвргнути серин хидроксиметилтрансферази 2 (SHMT2), кључном ензиму митохондријалног фолног циклуса. Значајан имуни одговор (слика S5D). У 13 акутних церебеларних резова инкубираних са CU-глукозом, експерименти метаболичког праћења додатно су потврдили повећану регулацију биосинтезе серина и пролина, што указује на повећање флукса изоформи угљеника у серин и пролин (слика S5E). Пошто су реакције које покрећу GLS и GPT2 одговорне за синтезу глутамата из глутамина и трансаминацију између глутамата и α-кетоглутарата, њихова појачана регулација указује да неурони са недостатком OXPHOS-а имају повећану потражњу за глутаматом. Ово може бити усмерено на одржавање повећане биосинтезе пролина (слика S5C). За разлику од ових промена, протеомска анализа церебеларних астроцита код PN-специфичних Mfn2cKO мишева показала је да се ови путеви (укључујући све антипероксидазе) нису значајно променили у експресији, што показује да је ово метаболичко преусмеравање селективно за деградирани PN (слика S6, D до G).
Укратко, ове анализе су откриле значајно различите обрасце временске активације специфичних метаболичких путева код периферних неурона. Иако абнормална неуронска митохондријална функција може довести до ране атеросклерозе и 1C ремоделирања (слика 3Е и слика S5C), па чак и предвидљивих промена у експресији I и IV комплекса, промене у de novo синтези серина су тек постале очигледне у каснијим фазама. OXPHOS дисфункција (слика 3Е и слика S5C). Ови налази дефинишу секвенцијални процес у којем стресом индуковани митохондријални (1C циклус) и цитоплазматски (биосинтеза серина) одговоре синергистички са повећањем атеросклерозе у TCA циклусу како би преобликовали неуронски метаболизам.
8 недеља старе ћелије са недостатком OXPHOS-а могу да одрже активност високофреквентне ексцитације и да се подвргну значајном метаболичком поновном повезивању како би компензовале митохондријалну дисфункцију. Ово откриће отвара занимљиву могућност да чак и у овом тренутку ове ћелије могу примити терапијску интервенцију како би се одложила или спречила неуродегенерација. Касно. Ову могућност смо решили кроз две независне интервенције. У првој методи, дизајнирали смо вектор Cre-зависног адено-асоцираног вируса (AAV) тако да се MFN2 може селективно експресовати у OXPHOS-дефицијентним PN in vivo (слика S7A). AAV који кодира MFN2 и флуоресцентни репортерски ген mCherry (Mfn2-AAV) су верификовани у примарним неуронским културама in vitro, што је довело до експресије MFN2 на Cre-зависан начин и спасило митохондријалну морфологију, чиме се спречава неуромутација у Mfn2cKO неуронима (слике S7, B, D и E). Затим, спровели смо in vivo експерименте стереотактичким путем убризгавања 8 недеља старог Mfn2-AAV у церебеларни кортекс Mfn2cKO и контролних мишева, и анализирали 12 недеља старе мишеве (Слика 4А). Третирани Mfn2cKO мишеви су угинули (Слика 1, А и Б) (16). Вирусна трансдукција in vivo је резултирала селективном експресијом PN у неким церебеларним круговима (Слика S7, Г и Х). Ињекција контролног AAV који експресује само mCherry (Ctrl-AAV) није имала значајан утицај на степен неуродегенерације код Mfn2cKO животиња. Насупрот томе, анализа Mfn2cKO трансдукованих са Mfn2-AAV показала је значајан заштитни ефекат слоја PN ћелија (Слика 4, Б и Ц). Посебно, густина неурона изгледа готово нераздвојива од контролних животиња (Слика 4, Б и Ц, и Слика S7, Х и И). Експресија MFN1, али не и MFN2, је подједнако ефикасна у спречавању неуронске смрти (слика 4C и слика S7, C и F), што указује да експресија ектопичног MFN1 може ефикасно да надокнади недостатак MFN2. Даља анализа на нивоу појединачне перитонеалне нуклеотидне ћелије (ПН) показала је да је Mfn2-AAV у великој мери спасао ултраструктуру митохондрија, нормализовао нивое mtDNA и преокренуо високу експресију маркера анти-ангиогенезе PCx ​​(слика 4, C до E). Визуелни преглед спасених Mfn2cKO мишева у стању мировања показао је да су им се држање и моторички симптоми (покрет S1 до S3) побољшали. Закључно, ови експерименти показују да је одложено поновно увођење MFN2 у ПН са озбиљним дефицитом OXPHOS довољно да преокрене потрошњу mtDNA и изазове атеросклерозу, чиме се спречава дегенерација аксона и неуронска смрт in vivo.
(А) Шема која приказује експериментални распоред за убризгавање ААВ који кодира MFN2 када је назначени метаболички пут активиран. (Б) Репрезентативне конфокалне слике 12 недеља старих церебеларних пресека трансдукованих у 8 недеља код Mfn2cKO мишева и обележених анти-калбиндин антителом. Десно: Скалирање аксонских влакана. Скала зумирања аксона је 450 и 75 μм. (Ц) Лево: Квантификација густине Пуркињеових ћелија у AAV трансдукционој петљи (AAV+) (једносмерна анализа варијансе; n = 3 мишева). Десно: анализа фокуса mtDNA у трансдукованој ПН у 12. недељи (неупарени t-тест; n = 6 ћелија од три миша). * P <0,05; ** P <0,01. (Д) Репрезентативне трансмисионе електронске микрографије ПН Mfn2cKO церебеларних пресека трансдукованих назначеним вирусним векторима. Ружичаста маска илуструје површину коју заузимају дендрити, а жути испрекидани квадрат илуструје зумирање са десне стране; n представља језгро. Скала, 1 μm. (E) приказује пример PCx бојења у PN трансдукованој након 12 недеља. Скала, 20 μm. OE, прекомерна експресија; FC, промена у броју преклопа.
Коначно, истражили смо значај преживљавања ћелија индукованог пероксидазом код периферних мачака (ПН) које су доживеле OXPHOS дисфункцију. Генерисали смо mCherry који кодира AAV-shRNA (кратку укосницу РНК) специфично усмерену на мишју PCx mRNA (AAV-shPCx) и убризгали вирус или његову контролу (AAV-scr) у мали мозак Mfn2cKO мишева. Ињекција је извршена у четвртој недељи старости (Слика 5А) како би се постигло ефикасно смањење PCx експресије током периода када је експресија PCx повећана (Слика 3C), а слој ПН ћелија је још увек био нетакнут (Слика 1А). Вреди напоменути да смањење PCx експресије (Слика S8A) доводи до значајног убрзања ПН смрти, која је ограничена на заражени прстен (Слика 5, Б и Ц). Да бисмо разумели механизам метаболичких ефеката изазваних појачаном регулацијом PCx, проучавали смо редокс статус периферних неурона (ПН) након што је PCx ​​обађен и AAV-посредовани оптички биосензор Grx1-roGFP2 истовремено експресован (слика S8, B до D) како бисмо проценили релативну промену редокс потенцијала пептида глутатиона (38). Затим смо извршили двофотонску флуоресцентну доживотну имагинг микроскопију (FLIM) у акутним пресецима мозга 7 недеља старих Mfn2cKO или контролних јединки из легла како бисмо открили потенцијалне промене у цитоплазматском редокс статусу након провере FLIM услова (слика S8, E до G). Анализа је показала значајно повећање оксидационог стања појединачних Mfn2cKO ПН којима недостаје PCx експресија, што се разликује од контролних неурона или Mfn2cKO ПН које експресују само помешану shRNA (слика 5, D и E). Када је експресија PCx смањена, проценат Mfn2cKO PN-ова који показују високо оксидовано стање повећао се за више од три пута (Слика 5Е), што указује да је повећана регулација PCx одржала редокс капацитет дегенерисаних неурона.
(А) Шема која приказује експериментални распоред за убризгавање AAV који кодира shPCx када је назначени метаболички пут активиран. (Б) Репрезентативне конфокалне фотографије 8 недеља старих пресека малог мозга код Mfn2cKO мишева трансдукованих и обележених анти-калцинеурин антителом након 4 недеље. Скала, 450μм. (Ц) Квантификација густине Пуркиње ћелија у AAV-трансдукованим петљама (једносмерна анализа варијансе; n = 3 до 4 мишева). Подаци су изражени као средња вредност ± SEM; ***P<0,001. (Д) Репрезентативна FLIM слика приказује просечан животни век 7 недеља старе PN која експресује глутатион редокс сензор Grx1-roGFP2 под наведеним експерименталним условима. LUT (look-up table) однос: временски интервал преживљавања (у пикосекундама). Скала, 25μм. (Е) Хистограм приказује дистрибуцију вредности животног века Grx1-roGFP2 од (Д) (n=158 до 368 ћелија код два миша под сваким условом). Кружни дијаграм изнад сваког хистограма: приказује број ћелија са значајно дужим (црвена, оксидована) или краћим (плава, смањена) вредностима животног века, које прелазе 1 SD просечне вредности животног века у CTRL-AAV-scr. (Ф) Предложени модел показује заштитни ефекат појачане регулације неуронског PCx.
Све у свему, подаци које овде пружамо показују да реекспресија MFN2 може потпуно да спасе узнапредовалу периферну нервну ћелију (ПН) са тешким недостатком OXPHOS, тешким смањењем mtDNA и изузетно абнормалном морфологијом сличном ista-форми, чиме се обезбеђује континуирани напредак чак и код узнапредовалих болести. Неуродегенерација пружа реверзибилне доказе о фази пре ћелијске смрти. Овај степен метаболичке флексибилности додатно је наглашен способношћу неурона да индукују атеросклерозу (преокретање TCA циклуса), што инхибира експресију PCx код ПН којима недостаје OXPHOS и појачава ћелијску смрт, чиме игра заштитну улогу (Слика 5F).
У овој студији, пружили смо доказе да је одговор периферних неурона (ПН) на дисфункцију OXPHOS постепена конвергенција ка атеросклерози ТЦА циклуса кроз диференцијални пут активације активиран метаболичким програмима. Потврдили смо протеомску анализу многим комплементарним методама и открили да, када су изазвани тешком митохондријалном дисфункцијом, неурони имају раније непознат облик метаболичке еластичности. На наше изненађење, цео процес поновног повезивања не означава нужно терминално метаболичко стање које постепено и неповратно прати неуродегенерацију, али наши подаци сугеришу да он може представљати неурон за одржавање чак и у фази пре ћелијске смрти. Функционални механизам компензације. Ово откриће указује на то да неурони имају значајан степен метаболичке пластичности у телу. Ова чињеница доказује да касније поновно увођење МФН2 може обрнути експресију кључних метаболичких маркера и спречити ПН дегенерацију. Напротив, инхибира атеросклерозу и убрзава нервни систем. транссексуалац.
Једно од најфасцинантнијих открића у нашем истраживању је да периферне ћелије којима недостаје OXPHOS могу да модификују метаболизам TCA циклуса повећањем ензима који специфично стимулишу артериосклерозу. Метаболичко преуређење је уобичајена карактеристика ћелија рака, од којих се неке ослањају на глутамин као допуну интермедијерима TCA циклуса како би произвеле редукујуће еквиваленте, који покрећу респираторни ланац и одржавају производњу прекурсора биосинтезе липида и нуклеотида (39, 40). Недавна студија је показала да је у периферним ткивима која доживљавају OXPHOS дисфункцију, поновно повезивање метаболизма глутамина/глутамата такође истакнута карактеристика (5, 41), где смер уласка глутамина у TCA циклус зависи од тежине OXPHOS повреде (41). Међутим, недостају јасни докази о било каквој сличности неуронске метаболичке пластичности у телу и њеној могућој релевантности у контексту болести. У недавној in vitro студији, показано је да примарни кортикални неурони мобилишу базене глутамата за неуротрансмисију, чиме подстичу оксидативни метаболизам и атеросклерозу у условима метаболичког стреса (42). Вреди напоменути да се под фармаколошком инхибицијом ензима сукцинат дехидрогеназе ТЦА циклуса, сматра да карбоксилација пирувата одржава синтезу оксалоацетата у култивисаним неуронима церебеларних гранула (34). Међутим, физиолошки значај ових механизама за мождано ткиво (где се сматра да је атеросклероза углавном ограничена на астроците) и даље има важан физиолошки значај (43). У овом случају, наши подаци показују да се периферне ћелије (ПН) оштећене OXPHOS-ом у телу могу пребацити на разградњу BCAA и карбоксилацију пирувата, што су два главна извора суплементације интермедијера TCA базена. Иако је предложен претпостављени допринос катаболизма BCAA неуронском енергетском метаболизму, поред улоге глутамата и GABA за неуротрансмисију (44), још увек нема доказа за ове механизме in vivo. Стога је лако претпоставити да дисфункционалне ПН могу аутоматски компензовати потрошњу ТЦА интермедијера вођену процесом асимилације повећањем атеросклерозе. Посебно, повећана регулација PCx може бити потребна да би се одржала повећана потражња за аспарагинском киселином, што се сугерише код пролиферирајућих ћелија са митохондријалном дисфункцијом (45). Међутим, наша метаболомичка анализа није открила никакве значајне промене у стабилном нивоу аспарагинске киселине у Mfn2cKO PN (слика S6A), што вероватно одражава различиту метаболичку употребу аспарагинске киселине између пролиферирајућих ћелија и постмитотских неурона. Иако тачан механизам повећане регулације PCx у дисфункционалним неуронима in vivo тек треба да се окарактерише, показали смо да овај превремени одговор игра важну улогу у одржавању редокс стања неурона, што је показано у FLIM експериментима на церебеларним пресецима. Посебно, спречавање PN да повећају PCx може довести до оксидованијег стања и убрзати ћелијску смрт. Активација разградње BCAA и карбоксилација пирувата нису начини за карактеризацију периферних ткива митохондријалне дисфункције (7). Стога, чини се да су приоритетна карактеристика неурона са недостатком OXPHOS, чак и ако нису једина карактеристика, која је важна за неуродегенерацију. .
Церебеларна болест је хетерогени тип неуродегенеративне болести која се обично манифестује као атаксија и често оштећује периферне ћелије (ПН) (46). Ова популација неурона је посебно осетљива на митохондријалну дисфункцију јер је њихова селективна дегенерација код мишева довољна да репродукује многе моторичке симптоме који карактеришу људску спиноцеребеларну атаксију (16, 47, 48). Према извештајима, трансгени модел миша са мутантним геном повезан је са људском спиноцеребеларном атаксијом и има митохондријалну дисфункцију (49, 50), што наглашава важност проучавања последица недостатка OXPHOS код ПНПХ. Стога је посебно погодно ефикасно изоловати и проучавати ову јединствену популацију неурона. Међутим, с обзиром на то да су ПН веома осетљиве на притисак и чине мали удео целокупне популације ћелија малог мозга, за многе студије засноване на омицима, селективно раздвајање истих као целих ћелија је и даље изазован аспект. Иако је готово немогуће постићи апсолутни недостатак контаминације других типова ћелија (посебно одраслих ткива), комбиновали смо ефикасан корак дисоцијације са FACS-ом како бисмо добили довољан број одрживих неурона за анализу протеомике низводно и имали прилично високу покривеност протеинима (око 3000 протеина) у поређењу са постојећим скупом података о целом малом мозгу (51). Очувањем одрживости целих ћелија, метод који овде пружамо нам омогућава не само да проверимо промене у метаболичким путевима у митохондријама, већ и да проверимо промене у њиховим цитоплазматским панданима, што допуњује употребу ознака митохондријалне мембране за обогаћивање ћелијског типа. Нова метода за број митохондрија у сложеним ткивима (52, 53). Метод који описујемо није повезан само са проучавањем Пуркињеових ћелија, већ се може лако применити на било који тип ћелија како би се решиле метаболичке промене у оболелим мозговима, укључујући и друге моделе митохондријалне дисфункције.
Коначно, идентификовали смо терапеутски прозор током овог процеса метаболичког преуређења који може потпуно да преокрене кључне знаке ћелијског стреса и спречи неуроналну дегенерацију. Стога, разумевање функционалних импликација овде описаног преуређења може пружити фундаментални увид у могуће третмане за одржавање неуронске виталности током митохондријалне дисфункције. Потребна су будућа истраживања усмерена на анализу промена у енергетском метаболизму у другим типовима можданих ћелија како би се у потпуности открила применљивост овог принципа на друге неуролошке болести.
МитоПарк мишеви су претходно описани (31). Мишеви C57BL/6N са loxP фланкирајућим Mfn2 генима су претходно описани (18) и укрштени са L7-Cre мишевима (23). Добијено двоструко хетерозиготно потомство је затим укрштено са хомозиготним Mfn2loxP/Mfn2loxP мишевима да би се генерисали Purkynje-специфични генски нокаути за Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). У подскупу парења, алел Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) је уведен додатним укрштањима (20). Све процедуре на животињама су спроведене у складу са европским, националним и институционалним смерницама и одобрене од стране LandesamtfürNatur of Umwelt и Verbraucherschutz, Северна Рајна-Вестфалија, Немачка. Рад на животињама такође прати смернице Европске федерације удружења за науку о лабораторијским животињама.
Након анестезије цервикалне дислокације труднице, ембрион миша је изолован (Е13). Кортекс је дисециран у Ханксовом уравнотеженом раствору соли (HBSS) допуњеном са 10 mM Hepes-а и прослеђен на Дулбековом модификованом Игловом медијуму који садржи папаин (20 U/ml) и цистеин (1μg/ml). Ткиво инкубирати у DMEM-у (средству за разградњу меморијске киселине) и дисоцирати га ензимском дигестијом (средство за разградњу меморијске киселине) на 37°C током 20 минута, а затим механички млевено у DMEM-у допуњеном са 10% феталног говеђег серума. Ћелије су посејане на стаклене покривне плочице обложене полилизином у густини од 2×10⁶ по посуди за култивацију од 6 цм или у густини од 0,5×10⁶ ћелија/цм² за анализу снимања. Након 4 сата, медијум је замењен неуробазалним медијумом без серума који садржи 1% додатка Б27 и 0,5 mM GlutaMax-а. Неурони су затим одржавани на 37°C и 5% CO2 током целог експеримента и храњени једном недељно. Да би се индуковала рекомбинација in vitro, 3 μl (посуда за култивацију са 24 бунарића) или 0,5 μl (плоча са 24 бунарића) следећег AAV9 вирусног вектора коришћено је за третирање неурона другог дана in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, каталошки број 105530-AAV9) и AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталошки број 105545-AAV9).
Комплементарна ДНК миша Mfn1 и Mfn2 (добијена из Addgene плазмида #23212 и #23213, респективно) означена је V5 секвенцом (GKPIPNPLLGLDST) на C-терминусу и спојена је са mCherry у оквиру преко T2A секвенце. Grx1-roGFP2 је поклон од Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Заменом tdTomato касете коришћењем конвенционалних метода клонирања, касета је субклонирана у pAAV-CAG-FLEX-tdTomato кичму (Addgene референтни број 28306) да би се генерисали pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 и pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 вектори. Слична стратегија је коришћена за генерисање контролног вектора pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Да би се генерисала AAV-shPCx конструкција, потребан је плазмидни AAV вектор (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), који садржи ДНК секвенцу која кодира shRNA усмерену на мишји PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Под контролом U6 промотора, користи се mCherry под контролом CMV промотора. Производња помоћних AAV вектора је спроведена према упутствима произвођача (Cell Biolabs). Укратко, користите трансфер плазмид који носи mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) за пролазну трансфекцију ћелија 293AAV - T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) или Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), као и кодирајући AAV1 капсидни протеин и помоћни протеин. Плазмид за паковање, методом калцијум фосфата. Сирови вирусни супернатант је добијен циклусима замрзавања и одмрзавања у купатилу са сувим ледом/етанолом и лизованим ћелијама у фосфатно пуферованом физиолошком раствору (PBS). Вектор AAV је пречишћен дисконтинуираном ултрацентрифугирањем са градијентом јодиксанола (24 сата на 32.000 о/мин и 4°C) и концентрован коришћењем центрифугалног филтера Amicon ultra-15. Титар генома AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 копија генома (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX је био као што је претходно описано (54), мерено квантитативном PCR у реалном времену (qPCR)-MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) и AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Примарни неурони су састругани у ледено хладном 1x PBS раствору, пелетирани, а затим хомогенизовани у 0,5% Triton X-100 / 0,5% натријум деоксихолат/PBS пуферу за лизу који садржи фосфатазу и инхибитор протеазе (Roche). Квантификација протеина је извршена коришћењем бицинхонинске киселине (Thermo Fisher Scientific). Протеини су затим раздвојени SDS-полиакриламидном гел електрофорезом, а затим блотирани на поливинилиден флуоридну мембрану (GE Healthcare). Блокирати неспецифична места и инкубирати са примарним антителом (видети Табелу S1 за детаље) у 5% млеку у TBST-у (Tris-пуферовани физиолошки раствор са Tween-ом), кораци прања и секундарно антитело у TBST инкубирати. Инкубирати са примарним антителом преко ноћи на +4°C. Након испирања, нанети секундарно антитело 2 сата на собној температури. Након тога, инкубацијом истог блота са анти-β-актин антителом, потврђено је исто пуњење. Детекција претварањем у хемилуминесценцију и појачавањем хемилуминесценције (GE Healthcare).
Неурони претходно посејани на покровна стакла су фиксирани са 4% параформалдехидом (PFA)/PBS у одређеном временском тренутку на собној температури током 10 минута. Покровна стакла су прво пермеата са 0,1% Triton X-100/PBS током 5 минута на собној температури, а затим у блокирајућем пуферу [3% говеђи серумски албумин (BSA)/PBS]. Другог дана, покровна стакла су испрана блокирајућим пуфером и инкубирана са одговарајућим секундарним антителом конјугованим са флуорофором током 2 сата на собној температури; коначно, узорци су темељно испрани у PBS-у са 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) су контрабојени, а затим фиксирани на предметно стакло микроскопа са Aqua-Poly/Mount.
Мишеви (мушки и женски) су анестезирани интраперитонеалном ињекцијом кетамина (130 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) и субкутано им је дат аналгетик карпрофен (5 мг/кг). Након тога, смештени су у стереотактички инструмент (Kopf) опремљен топлом подлогом. Отворите лобању и користите стоматолошку бушилицу да бисте истањили део малог мозга који одговара мис кости (од ламбда: реп 1,8, латерално 1, што одговара лобулама IV и V). Користите закривљену иглу шприца да бисте пажљиво направили малу рупу у лобањи како бисте избегли поремећај васкулатуре испод. Затим се танка стаклена капилара полако убацује у микро-рупу (од -1,3 до -1 на вентралној страни дура матер), а 200 до 300 нл ААВ се убризгава у микро-ињектор (Narishige) ручним шприцевима (Narishige) неколико пута под ниским притиском током временског периода од 10 до 20 минута. Након инфузије, капилар се поставља још 10 минута како би се вирус потпуно проширио. Након што се капилари повлаче, кожа се пажљиво зашива како би се минимизирала упала ране и омогућио опоравак животиње. Животиње су третиране аналгетицима (каспофен) неколико дана након операције, током којих је њихово физичко стање пажљиво праћено, а затим су еутаназиране у наведеном временском тренутку. Сви поступци су спроведени у складу са европским, националним и институционалним смерницама и одобрени су од стране LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Северна Рајна-Вестфалија, Немачка.
Животиње су анестезиране кетамином (100 мг/кг) и ксилазином (10 мг/кг), а срце је прво перфузирано са 0,1 М PBS, а затим са 4% PFA у PBS. Ткиво је дисецирано и фиксирано у 4% PFA/PBS преко ноћи на 4°C. Вибрирајући нож (Leica Microsystems GmbH, Беч, Аустрија) је коришћен за припрему сагиталних пресека (дебљине 50 μm) из фиксираног мозга у PBS. Осим ако није другачије назначено, бојење слободно плутајућих пресека је извршено као што је горе описано (13) на собној температури и уз мешање. Укратко, прво су добијени пресеци пермеабилизовани са 0,5% Triton X-100/PBS током 15 минута на собној температури; за неке епитопе (Pcx и Shmt2), загревањем пресека 25 минута у tris-EDTA пуферу на 80°C (pH 9) уместо овог корака. Затим су пресеци инкубирани са примарним антителом (видети Табелу S1) у блокирајућем пуферу (3% BSA/PBS) на 4°C преко ноћи уз мешање. Следећег дана, пресеци су испрани блокирајућим пуфером и инкубирани са одговарајућим секундарним антителом конјугованим са флуорофором током 2 сата на собној температури; коначно, пресеци су темељно испрани у PBS-у, контра-обојени са DAPI, а затим фиксирани са AquaPolymount на предметном стаклу микроскопа.
За снимање узорка коришћен је ласерски скенирајући конфокални микроскоп (TCS SP8-X или TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) опремљен ласером са белом светлошћу и ултраљубичастим ласером од 405 диода. Побуђивањем флуорофора и сакупљањем сигнала помоћу хибридног детектора (HyDs), коришћен је LAS-X софтвер за сакупљање наслаганих слика у складу са Најквистовим узорковањем у секвенцијалном режиму: за неквантитативне панеле, то су високо динамички сигнали (на пример, у соматским ћелијама и дендритима) (mtYFP). Користите HyD за детекцију броја PN у BrightR режиму. Примењује се синхронизација од 0,3 до 6 ns да би се смањила позадина.
Снимање сортираних ћелија у реалном времену. Након сортирања у Neurobasal-A медијуму који садржи 1% додатка B27 и 0,5 mM GlutaMax, ћелије су одмах посејане на стаклене плочице обложене поли-л-лизином (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталошки број 80826), а затим су држане на 37°C и 5% CO2 током 1 сата како би се ћелије слегле. Снимање у реалном времену је извршено на Leica SP8 ласерском скенирајућем конфокалном микроскопу опремљеном белим ласером, HyD, уљним објективом са 63×[1,4 нумеричка апертура (NA)] и постољем за загревање.
Миш је брзо анестезиран угљен-диоксидом и обезглављен, мозак је брзо уклоњен из лобање и исечен на сагиталне пресеке дебљине 200 μm (за експеримент обележавања 13C) или дебљине 275 μm (за експерименте са два фотона) испуњене следећим материјалима. Сладолед (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Валдорф, Немачка) је напуњен следећим супстанцама: 125 mM ледено хладан, угљеником засићени (95% O2 и 5% CO2) раствор цереброспиналне течности (ACSF) са ниским садржајем Ca2 + NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натријум-фосфатни пуфер, 25 mM NaHCO3, 25 mM глукоза, 0,5 mM CaCl2 и 3,5 mM MgCl2 (осмотски притисак од 310 до 330 mmol). Пребаците добијене кришке мозга у комору за претходну инкубацију која садржи виши Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натријум фосфатни пуфер, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-глукоза, 1,0 mM CaCl2 и 2,0 mM MgCl2) медијум) pH 7,4 и 310 до 320 mmol).
Током процеса снимања, пресеци су премештени у посебну просторију за снимање, а експеримент је изведен под континуираном перфузијом ACSF-а на константној температури од 32° до 33°C. За снимање пресека коришћен је мултифотонски ласерски скенирајући микроскоп (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) опремљен објективом Leica 25x (NA 0,95, вода) и Ti:сафирни ласер (Chameleon Vision II, Coherent). FLIM модул (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Промене у цитоплазматском редокс стању периферних ћелија мерене су двофотонским FLIM-ом у сагиталним пресецима мозга, где је биосензор Grx1-roGFP2 циљао периферне ћелије. У PN слоју, поље аквизиције је одабрано око 50 до 80 μм испод површине пресека како би се осигурало да постоји одржива периферна ћелија (тј. недостатак зрнасте структуре или неуронских морфолошких промена дуж дендрита) и двоструко позитивни roGFP2 сензор и AAV који кодирају shRNA PCx или њену контролну секвенцу (сваки коекспресује mCherry). Прикупљају се слике једног стека помоћу 2x дигиталног зума [таласна дужина побуђивања: 890 nm; 512 nm 512 пиксела]. Детекција: интерни HyD, флуоресцеин изотиоцијанат (FITC) филтер група] и усредњавање слике у року од 2 до 3 минута се користи како би се осигурало да се сакупи довољно фотона (укупно 1000 фотона) за фитовање криве. Осетљивост Grx1-roGFP2 сонде и верификација FLIM услова извршене су праћењем вредности животног века roGFP2 при додавању егзогених 10 mM H2O2 у перфузиони ACSF (да би се максимизирала оксидација, што резултира повећањем животног века), а затим додавањем 2 mM дитиотреитола (минимизира степен редукције, што резултира смањењем животног века) (слика S8, D до G). Користите FLIMfit 5.1.1 софтвер за анализу добијених резултата, уклопите криву јединственог експоненцијалног распада целе слике у измерену IRF (функцију одзива инструмента), а χ2 је приближно 1. Да би се израчунао животни век једне PN, маска око тела нерва је ручно нацртана, а просечан животни век у свакој маски је коришћен за квантификацију.
Анализа митохондријалног потенцијала. Након што је акутни пресек инкубиран са 100 nM TMRM директно додатим у перфузовани ACSF током 30 минута, промене митохондријалног потенцијала PN су мерене двофотонским микроскопом. TMRM снимање је извршено побуђивањем сонде на 920 nm и коришћењем интерног HyD (тетраметилродамин изотиоцијанат: 585/40 nm) за прикупљање сигнала; коришћењем исте таласне дужине побуђивања, али коришћењем другог интерног HyD (FITC: 525/50) за снимање mtYFP. Користите ImageJ-ов додатак Image Calculator за процену митохондријалног потенцијала на нивоу појединачне ћелије. Укратко, једначина додатка: сигнал = мин (mtYFP, TMRM) се користи за идентификацију митохондријалног региона који приказује TMRM сигнал у Пуркиње Сомалијском синдрому на конфокалној слици са једним слојем одговарајућег канала. Затим се површина пиксела у резултујућој маски квантификује, а затим нормализује на одговарајућој праговој слици једног слога mtYFP канала да би се добила митохондријална фракција која показује митохондријални потенцијал.
Слика је деконволюирана помоћу софтвера Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). За скениране слике плочица, монтажа једне плочице је направљена коришћењем алгоритма за аутоматско спајање који је обезбедио LAS-X софтвер. Након калибрације слике, користите ImageJ и Adobe Photoshop за даљу обраду слике и равномерно подешавање осветљености и контраста. За графичку припрему користите Adobe Illustrator.
Анализа фокуса мтДНК. Број мтДНК лезија је квантификован на церебеларним пресецима обележеним антителима против ДНК помоћу конфокалног микроскопа. Свака циљна област је креирана за тело ћелије и једро сваке ћелије, а одговарајућа површина је израчуната помоћу додатка Multi Measure (софтвер ImageJ). Одузмите површину једра од површине тела ћелије да бисте добили цитоплазматску површину. Коначно, додатак Analyze Particles (софтвер ImageJ) је коришћен за аутоматску квантификовање цитоплазматских ДНК тачака које указују на мтДНК на праговој слици, а добијени резултати су нормализовани на PN просек CTRL мишева. Резултати су изражени као просечан број нуклеозида по ћелији.
Анализа експресије протеина. Користите ImageJ-ов додатак Image Calculator да бисте проценили експресију протеина у ПН на нивоу појединачне ћелије. Укратко, на једнослојној конфокалној слици одговарајућег канала, помоћу једначине: сигнал = мин (mtYFP, антитело), ​​идентификује се митохондријални регион који показује имунореактивност на одређено антитело у Пуркини. Затим се површина пиксела у резултујућој маски квантификује, а затим нормализује на одговарајућој праговој једноћелијској слици mtYFP канала да би се добила митохондријална фракција приказаног протеина.
Анализа густине Пуркињеових ћелија. Додатак Cell Counter програма ImageJ коришћен је за процену густине Пуркињеових ћелија дељењем броја пребројаних Пуркињеових ћелија дужином церебеларног прстена који заузимају пребројане ћелије.
Припрема и сакупљање узорака. Мозгови из контролне групе и Mfn2cKO мишева су фиксирани у 2% PFA/2,5% глутаралдехида у 0,1 M фосфатном пуферу (PB), а затим су припремљени коронални пресеци коришћењем цилијата (Leica Mikrosysteme GmbH, Беч, Аустрија) (дебљина 50 до 60 μm). Затим су фиксирани у PB пуферу у 1% тетраоксиду и 1,5% калијум фероцијаниду на собној температури током 1 сата. Пресеци су испрани три пута дестилованом водом, а затим обојени 70% етанолом који садржи 1% уранил ацетата током 20 минута. Пресеци су затим дехидрирани у градуираном алкохолу и уграђени у епоксидну смолу Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, каталошки број 14040) између силиконски обложених стаклених плочица, и коначно на 60°C полимеризовани у пећи током 48 сати. Одабрано је подручје церебеларне коре и ултратанки пресеци дебљине 50 nm су исечени на Leica Ultracut-у (Leica Mikrosysteme GmbH, Беч, Аустрија) и одабрани на бакарној мрежи са прорезима димензија 2×1 mm пресвученој полистиренским филмом. Пресеци су обојени раствором 4% уранил ацетата у H2O током 10 минута, испрани са H2O неколико пута, затим Рејнолдсовим оловним цитратом у H2O током 10 минута, а потом испрани са H2O неколико пута. Микрографије су снимљене трансмисионим електронским микроскопом Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Волтам, Масачусетс, САД) коришћењем дигиталне камере TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Гаутинг, САД). Немачка).
Код мишева инфицираних ААВ-ом, мозак је одвојен и исечен на сагитални пресеци дебљине 1 мм, а мали мозак је прегледан флуоресцентним микроскопом како би се идентификовао прстен инфициран ААВ-ом (то јест, који експресује mCherry). Коришћени су само експерименти у којима ААВ ињекција резултира веома високом ефикасношћу трансдукције слоја Пуркињеових ћелија (тј. скоро целог слоја) у најмање два узастопна церебеларна прстена. ААВ-трансдукована петља је микродисекована за постфиксацију преко ноћи (4% PFA и 2,5% глутаралдехида у 0,1 М кокоатном пуферу) и даље обрађена. За уградњу EPON-а, фиксирано ткиво је испрано са 0,1 М натријум кокоатним пуфером (Applichem) и инкубирано са 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) у 0,1 М натријум кокоатном пуферу (Applichem) 4 сата, а затим испрано 2 сата. Поновити 3 пута са 0,1 М кокамидним пуфером. Након тога, узлазни низ етанола је коришћен за инкубацију сваког раствора етанола на 4°C током 15 минута ради дехидрације ткива. Ткиво је пребачено у пропилен оксид и инкубирано преко ноћи у EPON-у (Sigma-Aldrich) на 4°C. Ткиво је стављено у свеж EPON на собној температури на 2 сата, а затим је уграђено на 62°C током 72 сата. Користећи ултрамикротом (Leica Microsystems, UC6) и дијамантски нож (Diatome, Biel, Швајцарска) исечени су ултратанки пресеци од 70 nm, а затим обојени са 1,5% уранил ацетатом током 15 минута на 37°C, и обојени раствором олово цитрата 4 минута. Електронске микрографије су снимљене помоћу JEM-2100 Plus трансмисионог електронског микроскопа (JEOL) опремљеног Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) и DigitalMicrograph софтвером (Gatan). За анализу, електронске микрографије су снимљене са дигиталним зумом од 5000× или 10.000×.
Морфолошка анализа митохондрија. За све анализе, контуре појединачних митохондрија су ручно оцртане на дигиталним сликама помоћу софтвера ImageJ. Анализирани су различити морфолошки параметри. Густина митохондрија је изражена као проценат добијен дељењем укупне површине митохондрија сваке ћелије површином цитоплазме (површина цитоплазме = површина ћелије - површина ћелијског једра) × 100. Округлост митохондрија је израчуната формулом [4π∙(површина/периметар 2)]. Анализирана је морфологија митохондрија и подељена у две категорије („цевасте“ и „пликовисте“) према њиховим главним облицима.
Анализа броја и густине аутофагозома/лизозома. Користите софтвер ImageJ да ручно оцртате контуре сваког аутофагозома/лизозома на дигиталној слици. Површина аутофагозома/лизозома изражава се као проценат израчунат дељењем укупне површине структуре аутофагозома/лизозома сваке ћелије површином цитоплазме (површина цитоплазме = површина ћелије - површина једра) × 100. Густина аутофагозома/лизозома израчунава се дељењем укупног броја са бројем структура аутофагозома/лизозома по ћелији (у смислу цитоплазматске површине) (цитоплазматска површина = површина ћелије - површина једра).
Обележавање за акутно сечење и припрему узорака. За експерименте који захтевају обележавање глукозом, пребаците акутни пресеци мозга у комору за претходну инкубацију, која садржи засићени угљеник (95% O2 и 5% CO2), висок Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натријум фосфатни пуфер, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-глукоза, 1,0 mM CaCl2 и 2,0 mM MgCl2, подешено на pH 7,4 и 310 до 320 mOsm), у којој је глукоза 13C6- глукозна супституција (Eurisotop, каталошки број CLM-1396). За експерименте који захтевају обележавање пируватом, пребаците акутни пресеци мозга у виши Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натријум фосфатни пуфер, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-глукоза, 1,0 mM CaCl2 и додајте 2,0 mM MgCl2, подесите pH на 7,4 и 310 до 320mOsm) и додајте 1 mM 1-[1-13C]пирувата (Eurisotop, каталошки број CLM-1082). Инкубирајте пресеке 90 минута на 37°C. На крају експеримента, пресеци су брзо испрани воденим раствором (pH 7,4) који садржи 75 mM амонијум карбоната, а затим хомогенизовани у 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрилу (ACN):метанолу:води. Након што су пресеци инкубирани на леду 30 минута, узорци су центрифугирани на 21.000 g током 10 минута на 4°C, а бистри супернатант је осушен у SpeedVac концентратору. Добијени осушени метаболитни пелет је чуван на -80°C до анализе.
Анализа аминокиселина обележених са 13C методом течне хроматографије-масене спектрометрије. За анализу течном хроматографијом-масене спектрометријом (LC-MS), пелет метаболита је ресуспендован у 75 μl воде LC-MS квалитета (Honeywell). Након центрифугирања на 21.000 g током 5 минута на 4°C, 20 μl пречишћеног супернатанта је коришћено за анализу флукса аминокиселина, док је остатак екстракта одмах коришћен за анализу ањона (видети доле). Анализа аминокиселина је извршена коришћењем претходно описаног протокола дериватизације бензоил хлорида (55, 56). У првом кораку, 10 μl 100 mM натријум карбоната (Sigma-Aldrich) је додато у 20 μl екстракта метаболита, а затим је 10 μl 2% бензоил хлорида (Sigma-Aldrich) додато у ACN LC квалитета. Узорак је кратко вортексован, а затим центрифугиран на 21.000 g током 5 минута на 20°C. Пребаците пречишћени супернатант у бочицу за аутосамплер од 2 ml са конусним стакленим улошком (запремине 200 μl). Узорци су анализирани коришћењем Acquity iClass LC система ултра високих перформанси (Waters) повезаног са Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) прецизним масеним спектрометром високе резолуције (Thermo Fisher Scientific). За анализу, 2 μl дериватизованог узорка је убризгано у колону од силицијум диоксида високе чврстоће димензија 100×1,0 mm (Waters) која садржи честице величине 1,8 μm. Брзина протока је 100 μl/min, а пуферски систем се састоји од пуфера А (10 mM амонијум формијат и 0,15% мравља киселина у води) и пуфера Б (ACN). Градијент је следећи: 0%B на 0 минута; 0%B. 0 до 15% B на 0 до 0,1 минут; 15 до 17% B на 0,1 до 0,5 минута; B на 17 до 55% на 0,5 до 14 минута; B на 55 до 70% на 14 до 14,5 минута; на 14,5 до 70 до 100% B на 18 минута; 100% B на 18 до 19 минута; 100 до 0% B на 19 до 19,1 минута; 0% B на 19,1 до 28 минута (55, 56). QE-HF масени спектрометар ради у режиму позитивне јонизације са опсегом масе m/z (однос масе/наелектрисања) од 50 до 750. Примењена резолуција је 60.000, а добијена јонска мета контроле појачања (AGC) је 3×106, а максимално време јона је 100 милисекунди. Загрејани извор јонизације електроспрејом (ESI) ради на напону прскања од 3,5 kV, температури капиларне капиле од 250°C, протоку ваздуха кроз плашт од 60 AU (произвољних јединица) и помоћном протоку ваздуха од 20 AU. 250°C. S сочиво је подешено на 60 AU.
Анализа органских киселина обележених са 13C методом анјонске хроматографије-МС. Преостали талог метаболита (55 μl) је анализиран коришћењем Dionex система јонске хроматографије (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) повезаног са QE-HF масеним спектрометром (Thermo Fisher Scientific). Укратко, 5 μl екстракта метаболита је убризгано у Dionex IonPac AS11-HC колону опремљену HPLC-ом (2 mm × 250 mm, величина честица 4 μm, Thermo Fisher Scientific) у режиму делимичне петље са убацивањем и односом пуњења од 1. ) Dionex IonPac AG11-HC заштитна колона (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Температура колоне се одржава на 30°C, а аутосемплер је подешен на 6°C. Користите кертриџ калијум хидроксида са дејонизованом водом да бисте генерисали градијент калијум хидроксида кроз генератор елуента. Раздвајање метаболита при брзини протока од 380μl/min, применом следећег градијента: 0 до 3 минута, 10 mM KOH; 3 до 12 минута, 10 до 50 mM KOH; 12 до 19 минута, 50 до 100 mM KOH; 19 до 21 минут, 100 mM KOH; 21 до 21,5 минута, 100 до 10 mM KOH. Колона је поново уравнотежена под 10 mM KOH током 8,5 минута.
Елуирани метаболити се комбинују са додатним током изопропанола од 150 μl/min након колоне, а затим се усмеравају ка масеном спектрометару високе резолуције који ради у режиму негативне јонизације. MS прати опсег масе од m/z 50 до 750 са резолуцијом од 60.000. AGC је подешен на 1×106, а максимално време јона је одржавано на 100 ms. Загрејани ESI извор је радио на напону прскања од 3,5 kV. Остала подешавања јонског извора су следећа: температура капиларне капиле 275°C; проток гаса омотача, 60 AU; проток помоћног гаса, 20 AU на 300°C и подешавање S сочива на 60 AU.
Анализа података метаболита обележених са 13C. Користити софтвер TraceFinder (верзија 4.2, Thermo Fisher Scientific) за анализу података односа изотопа. Идентитет сваког једињења је верификован помоћу поузданог референтног једињења и независно анализиран. Да би се извршила анализа обогаћивања изотопа, површина екстрахованог јонског хроматограма (XIC) сваког изотопа 13C (Mn) је екстрахована из [M + H] +, где је n број угљеника циљног једињења, који се користи за анализу аминокиселина или [MH] + који се користи за анализу ањона. Тачност масе XIC је мања од пет делова на милион, а тачност RT је 0,05 минута. Анализа обогаћивања се врши израчунавањем односа сваког детектованог изотопа према збиру свих изотопа одговарајућег једињења. Ови односи су дати као процентуалне вредности за сваки изотоп, а резултати су изражени као моларни проценат обогаћивања (MPE), као што је претходно описано (42).
Замрзнути неуронски пелет је хомогенизован у ледено хладном метанолу од 80% (v/v), вортексован и инкубиран на -20°C током 30 минута. Узорак је поново вртложен и мешан на +4°C током 30 минута. Узорак је центрифугиран на 21.000 g током 5 минута на 4°C, а затим је добијени супернатант сакупљен и осушен помоћу SpeedVac концентратора на 25°C за накнадну анализу. Као што је горе описано, LC-MS анализа је извршена на аминокиселинама сортираних ћелија. Користећи TraceFinder (верзија 4.2, Thermo Fisher Scientific), анализа података је извршена коришћењем моноизотопске масе сваког једињења. Квантилна нормализација података о метаболитима је извршена коришћењем софтверског пакета preprocessCore (57).
Припрема резова. Миш је брзо анестезиран угљен-диоксидом и обезглављен, мозак је брзо уклоњен из лобање, а вибрирајући нож напуњен ледом (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Валдорф, Немачка) је коришћен за сечење на сагиталне резове од 300 до 375 μm. Хладна гасификација угљеником (95% O2 и 5% CO2). Низак Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натријум-фосфатни пуфер, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-глукоза, 1,0 mM CaCl2 и 6,0 mM MgCl2. Подесити pH на 7,4 и 310 до 330 mOsm). Пребаците добијене резове мозга у комору која садржи виши Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натријум фосфатни пуфер, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-глукоза, 4,0 mM CaCl2 и 3,5 mM MgCl2) pH 7,4 и 310 до 320 mOsm). Чувајте резове 20 до 30 минута како би се могли рестаурирати пре снимања.
Снимање. За сва снимања коришћено је постоље микроскопа опремљено фиксном комором за снимање и објективом за иморијецију у воду са увећањем од 20 пута (Scientifica). Претпостављене Пуркињеове ћелије су идентификоване (i) величином тела, (ii) анатомском локацијом малог мозга и (iii) експресијом флуоресцентног mtYFP репортерског гена. Патч пипета са отпором врха од 5 до 11 мегаома извлачи се помоћу боросиликатне стаклене капиларе (GB150-10, 0,86 мм × 1,5 мм × 100 мм, Science Products, Хофхајм, Немачка) и хоризонталне пипете Instruments (P-1000, Sutter), Новато, Калифорнија. Сва снимања су обављена помоћу ELC-03XS npi патч клемп појачала (npi electronic GmbH, Там, Немачка), којим је управљао софтвер Signal (верзија 6.0, Cambridge Electronic, Кембриџ, Велика Британија). Експеримент је снимљен фреквенцијом узорковања од 12,5 kHz. Сигнал се филтрира помоћу два краткопропусна Беселова филтера са граничним фреквенцијама од 1,3 и 10 kHz, респективно. Капацитивност мембране и пипете компензује се компензационим колом помоћу појачала. Сви експерименти су изведени под контролом Orca-Flash 4.0 камере (Хамамацу, Герден, Немачка), којом је управљао Hokawo софтвер (верзија 2.8, Хамамацу, Герден, Немачка).
Рутинска конфигурација и анализа целих ћелија. Непосредно пре снимања, напуните пипету унутрашњим раствором који садржи следеће супстанце: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM калијум глуконат, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM гуанозин трифосфат (GTP) (Na) и 10,0 mM креатинин фосфат су подешени на pH 7,25, а осмотски притисак је био 290 mOsm (сахароза). Одмах након примене силе од 0 pA да би се пробила мембрана, измерен је мембрански потенцијал у мировању. Улазни отпор се мери применом хиперполаризованих струја од -40, -30, -20 и -10 pA. Измерите величину напонског одзива и користите Омов закон за израчунавање улазног отпора. Спонтана активност је забележена у напонском стезачу током 5 минута, а sPSC је идентификован и мерен у програму Igor Pro (верзија 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, САД) коришћењем полуаутоматског скрипта за препознавање. IV крива и струја стационарног стања мере се стезањем батерије на различитим потенцијалима (почевши од -110 mV) и повећањем напона у корацима од 5 mV. Производња AP је тестирана применом деполаризујуће струје. Стезати ћелију на -70 mV док примењујете импулс деполаризујуће струје. Подесите величину корака сваке јединице за снимање посебно (10 до 60 pA). Израчунајте максималну AP фреквенцију ручним бројањем импулсних шиљака који узрокују највишу AP фреквенцију. AP праг се анализира коришћењем другог извода деполаризационог импулса који први покреће један или више AP.
Конфигурација и анализа перфорираног фластера. Извршите снимање перфорираног фластера користећи стандардне протоколе. Користите пипету без АТП-а и ГТП-а која не садржи следеће састојке: 128 mM глуконата К, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA и 2 mM MgCl2, и подесите pH на 7,2 (коришћењем KOH). АТП и ГТП су изостављени из интрацелуларног раствора како би се спречила неконтролисана пропустљивост ћелијске мембране. Пипета са фластером је напуњена унутрашњим раствором који садржи амфотерицин (приближно 200 до 250μг/мл; G4888, Sigma-Aldrich) да би се добио запис перфорираног фластера. Амфотерицин је растворен у диметил сулфоксиду (коначна концентрација: 0,1 до 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Концентрација коришћеног DMSO није имала значајан утицај на проучаване неуроне. Током процеса бушења, отпор канала (Ra) је континуирано праћен, а експеримент је започет након што се амплитуда Ra и AP стабилизовала (20-40 минута). Спонтана активност се мери у напонским и/или струјним стезаљкама током 2 до 5 минута. Анализа података је извршена коришћењем програма Igor Pro (верзија 7.05.2, WaveMetrics, САД), Excel (верзија 2010, Microsoft Corporation, Редмонд, САД) и GraphPad Prism (верзија 8.1.2, GraphPad Software Inc., Ла Хоја, Калифорнија). Да би се идентификовали спонтани AP, користи се IgorPro-ов NeuroMatic v3.0c додатак. Аутоматски идентификујте AP користећи дати праг, који се подешава појединачно за сваки запис. Користећи интервал спајкова, одредите фреквенцију спајкова са максималном тренутном фреквенцијом спајкова и просечном фреквенцијом спајкова.
Изолација ПН. Прилагођавањем претходно објављеном протоколу, ПН су пречишћене из малог мозга миша у одређеној фази (58). Укратко, мали мозак је дисециран и уситњен у ледено хладном медијуму за дисоцијацију [без HBSS Ca2+ и Mg2+, допуњен са 20 mM глукозе, пеницилина (50 U/ml) и стрептомицина (0,05 mg/ml)], а затим је медијум дигестиран у папаину [HBSS, допуњен са 1-цистеин·HCl (1 mg/ml), папаином (16 U/ml) и дезоксирибонуклеазом I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Третирати 30 минута на 30°C. Прво испрати ткива у HBSS медијуму који садржи јајну слуз (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) и ДНазу (0,1 мг/мл) на собној температури да би се спречила ензимска дигестија, а затим у HBSS медијуму који садржи 20 mM глукозе. Нежно млевење у HBSS-у, пеницилину (50 U/мл), стрептомицину (0,05 мг/мл) и ДНази (0,1 мг/мл) ослобађа појединачне ћелије. Добијена суспензија ћелија је филтрирана кроз цедиљку за ћелије од 70 μm, затим су ћелије пелетиране центрифугирањем (1110 о/мин, 5 минута, 4°C) и ресуспендоване у медијуму за сортирање [HBSS, допуњен са 20 mM глукозе, 20% феталног говеђег серума, пеницилина (50 U/мл) и стрептомицина (0,05 мг/мл)]; проценити виталност ћелија помоћу пропидијум јодида и подесити густину ћелија на 1×10⁶ до 2×10⁶ ћелија/мл. Пре проточне цитометрије, суспензија је филтрирана кроз ћелијско цедило од 50 μм.
Проточни цитометар. Сортирање ћелија је извршено на 4°C коришћењем FACSAria III машине (BD Biosciences) и FACSDiva софтвера (BD Biosciences, верзија 8.0.1). Ћелијска суспензија је сортирана коришћењем млазнице од 100 μm под притиском од 20 psi брзином од ~2800 догађаја/сек. Пошто традиционални критеријуми за гејтинг (величина ћелија, бимодална дискриминација и карактеристике расејања) не могу да обезбеде исправну изолацију PN од других типова ћелија, стратегија гејтинга је постављена на основу директног поређења интензитета YFP и аутофлуоресценције код mitoYFP+ ​​​​и контролних mitoYFP − мишева. YFP се побуђује зрачењем узорка ласерском линијом од 488 nm, а сигнал се детектује коришћењем филтера пропусног опсега од 530/30 nm. Код mitoYFP+ ​​​​мишева, релативна јачина Rosa26-mitoYFP репортерског гена се такође користи за разликовање фрагмената неуронског тела и аксона. 7-AAD се побуђује жутим ласером од 561 nm и детектује филтером пропусног опсега од 675/20 nm како би се искључиле мртве ћелије. Да би се истовремено одвојили астроцити, ћелијска суспензија је обојена са ACSA-2-APC, затим је узорак озрачен ласерском линијом од 640 nm, а за детекцију сигнала је коришћен филтер пропусног опсега од 660/20 nm.
Сакупљене ћелије су пелетиране центрифугирањем (1110 о/мин, 5 минута, 4°C) и чуване на -80°C до употребе. Mfn2cKO мишеви и њихови младунци из легла су класификовани истог дана како би се минимизирала варијабилност процедура. FACS презентација и анализа података су извршене коришћењем FlowJo софтвера (FlowJo LLC, Ашланд, Орегон, САД).
Као што је горе поменуто (59), PCR у реалном времену се користи за изоловање ДНК из сортираних неурона за накнадну квантификацију мтДНК. Линеарност и праг осетљивости су првобитно тестирани покретањем qPCR на различитом броју ћелија. Укратко, сакупити 300 PN у пуферу за лизу који се састоји од 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 и протеиназе К (200 нг/мл) и инкубирати на 55°C 120 минута. Ћелије су даље инкубиране на 95°C током 10 минута како би се осигурала потпуна инактивација протеиназе К. Користећи TaqMan сонду (Thermo Fisher) специфичну за mt-Nd1, мтДНК је мерена полуквантитативном PCR у 7900HT Real-Time PCR систему (Thermo Fisher Scientific). Science, каталошки број Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, каталошки број AIVI3E8) и 18S (Thermo Fisher Scientific, каталошки број Hs99999901_s1) гени.
Припрема узорка протеома. Загревањем раствора на 95°C током 10 минута и соникацијом, у пуферу за лизу [6 M гванидин хлорид, 10 mM трис(2-карбоксиетил) фосфин хидрохлорид, 10 mM хлороацетамид и 100 mM трис-Лизе замрзнутих неуронских пелета у HCl]. На Bioruptor-у (Diagenode) током 10 минута (30 секунди пулса / 30 секунди паузе). Узорак је разблажен 1:10 у 20 mM трис-HCl (pH 8,0), помешан са 300 ng трипсинског злата (Promega) и инкубиран преко ноћи на 37°C да би се постигла потпуна дигестија. Другог дана, узорак је центрифугиран на 20.000 g током 20 минута. Супернатант је разблажен са 0,1% мрављом киселином, а раствор је десониран помоћу самостално направљених StageTips конектора. Узорак је осушен у SpeedVac инструменту (Eppendorf concentrator plus 5305) на 45°C, а затим је пептид суспендован у 0,1% мрављој киселини. Све узорке је истовремено припремила иста особа. Да би се анализирали узорци астроцита, 4 μг десољених пептида је обележено тандемском масеном ознаком (TMT10plex, каталошки број 90110, Thermo Fisher Scientific) са односом пептида и TMT реагенса од 1:20. За TMT обележавање, 0,8 mg TMT реагенса је ресуспендовано у 70 μl безводног ACN, а осушени пептид је реконституисан у 9 μl 0,1 M TEAB (триетиламонијум бикарбонат), коме је додато 7 μl TMT реагенса у ACN. Концентрација је била 43,75%. Након 60 минута инкубације, реакција је угашена са 2 μl 5% хидроксиламина. Обележени пептиди су сакупљени, осушени, ресуспендовани у 200 μl 0,1% мравље киселине (FA), подељени на два дела, а затим десољени коришћењем самостално направљених StageTips конектора. Користећи UltiMate 3000 ултра високо ефикасни течни хроматограф (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), једна од две половине је фракционисана на 1mm x 150mm Acquity хроматографској колони напуњеној са 130Å1.7μm C18 честицама (Waters, каталошки број SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Раздвојити пептиде брзином протока од 30μl/min, раздвојити од 1% до 50% пуфера Б током 85 минута са постепеним градијентом од 96 минута, од 50% до 95% пуфера Б током 3 минута, затим 8 минута за 95% пуфера Б; Пуфер А је 5% ACN и 10 mM амонијум бикарбоната (ABC), а пуфер Б је 80% ACN и 10 mM ABC. Сакупљајте фракције свака 3 минута и комбинујте их у две групе (1 + 17, 2 + 18, итд.) и осушите их у вакуумској центрифуги.
LC-MS/MS анализа. За масену спектрометрију, пептиди (број r119.aq) су раздвојени на аналитичкој колони PicoFrit од 25 cm, унутрашњег пречника 75 μm (ново објективно сочиво, број дела PF7508250) опремљеној са 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ медијумом (Dr. Maisch, mat), користите EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Немачка). Колона је одржавана на 50°C. Пуфери А и Б су 0,1% мравље киселине у води и 0,1% мравље киселине у 80% ACN, респективно. Пептиди су раздвојени од 6% до 31% пуфера Б током 65 минута и од 31% до 50% пуфера Б током 5 минута са градијентом од 200 nl/min. Елуирани пептиди су анализирани на масеном спектрометру Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Мерење m/z прекурсора пептида врши се са резолуцијом од 120.000 у опсегу од 350 до 1500 m/z. Користећи 27% нормализоване енергије судара, најјачи прекурсор са стањем наелектрисања од 2 до 6 је одабран за цепање дисоцијацијом C замке високе енергије (HCD). Време циклуса је подешено на 1 s. m/z вредност пептидног фрагмента је мерена у јонској замци коришћењем најмање AGC мете од 5×104 и максималног времена убризгавања од 86 ms. Након фрагментације, прекурсор је стављен на динамичку листу искључења на 45 s. ТМТ-обележени пептиди су раздвојени на Acclaim PepMap колони од 50 цм, 75 μм (Thermo Fisher Scientific, каталошки број 164942), а миграциони спектри су анализирани на Orbitrap Lumos Tribrid масеном спектрометру (Thermo Fisher Scientific) опремљеном опремом за асиметричне јоне високог поља са високим таласним обликом (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) која ради на два напона компензације од -50 и -70 V. MS3 изабран на основу прекурсора синхронизације користи се за мерење сигнала ТМТ јона. Раздвајање пептида је извршено на EASY-nLC 1200, коришћењем елуције са линеарним градијентом од 90%, са концентрацијом пуфера од 6% до 31%; пуфер А је био 0,1% FA, а пуфер Б је био 0,1% FA и 80% ACN. Аналитичка колона ради на 50°C. Користите FreeStyle (верзија 1.6, Thermo Fisher Scientific) да бисте поделили оригиналну датотеку према напону компензације FAIMS.
Идентификација и квантификација протеина. Коришћењем интегрисаног претраживача Andromeda, оригинални подаци су анализирани помоћу MaxQuant верзије 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Поред секвенци Cre рекомбиназе и YFP добијених из Aequorea victoria, спектри пептидних фрагмената су претражени за канонску секвенцу и изоформну секвенцу референтног протеома миша (Proteome ID UP000000589, преузет са UniProt-а у мају 2017). Оксидација метионина и N-терминална ацетилација протеина су подешене као варијабилне модификације; метилација цистеин карбамоила је подешена као фиксне модификације. Параметри варења су подешени на „специфичност“ и „трипсин/P“. Минималан број пептида и razor пептида који се користе за идентификацију протеина је 1; минималан број јединствених пептида је 0. Под условима подударања мапе пептида, стопа идентификације протеина је била 0,01. Опција „Други пептид“ је омогућена. Користите опцију „подударање између рунова“ да бисте пренели успешне идентификације између различитих оригиналних датотека. Користите LFQ минимални однос броја 1 за квантификацију без ознака (LFQ) (60). Интензитет LFQ се филтрира за најмање две валидне вредности у најмање једној генотипској групи у свакој временској тачки и екстраполира се из нормалне дистрибуције ширине од 0,3 и помера се надоле за 1,8. Користите Perseus рачунарску платформу (https://maxquant.net/perseus/) и R (https://r-project.org/) за анализу LFQ резултата. Двосмерни умерени t-тест из софтверског пакета Limma коришћен је за анализу диференцијалне експресије (61). Експлоративна анализа података је извршена коришћењем ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally и pheatmap. Подаци протеомике засновани на TMT-у анализирани су коришћењем MaxQuant верзије 1.6.10.43. Претражите сирове протеомичке податке из UniProt-ове базе података о људској протеомици, која је преузета у септембру 2018. Анализа укључује фактор корекције чистоће изотопа који је обезбедио произвођач. Користите лиму у R-у за анализу диференцијалних израза. Оригинални подаци, резултати претраге базе података и ток рада и резултати анализе података чувају се у ProteomeXchange савезу преко PRIDE партнерског репозиторијума са идентификатором скупа података PXD019690.
Функционалне анотације обогаћују анализу. Алат Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) коришћен је за одређивање богатства термина функционалних анотација скупа података након 8 недеља (Слика 1). Укратко, квантитативна листа протеина добијена анализом података LC-MS/MS (тандем масена спектрометрија) користи се са следећим критеријумима филтера: Mus musculus је изабран као врста и позадина, а категорија приказује да се P вредност прилагођена Бенџаминијем за обогаћивање 0,05 или ниже сматра значајном. За овај графикон приказано је пет највећих вишкова категорија у сваком кластеру на основу прилагођене P вредности. Користећи вишеструки t-тест, користећи двостепени линеарни програм појачања Бенџаминија, Кригера и Јекутијелија (Q = 5%), анализа експресије протеина током времена врши се на важним кандидатима идентификованим у свакој категорији, а сваки ред се анализира засебно. Нема потребе за усвајањем конзистентне стандардне девијације (SD).
Да бисмо упоредили резултате ове студије са објављеним базама података и генерисали Венов дијаграм на слици 1, комбиновали смо квантитативну листу протеина са анотацијама из програма MitoCarta 2.0 (24). Користите онлајн алатку Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) да бисте генерисали дијаграм.
За детаљне информације о статистичким процедурама које се користе за протеомску анализу, погледајте одговарајући одељак Материјали и методе. За све остале експерименте, детаљне информације могу се наћи у одговарајућој легенди. Осим ако није другачије назначено, сви подаци су изражени као средња вредност ± SEM, а све статистичке анализе су извршене помоћу софтвера GraphPad Prism 8.1.2.
За додатне материјале за овај чланак, погледајте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ово је чланак отвореног приступа дистрибуиран под условима Creative Commons Attribution-Non-Commercial лиценце, која дозвољава употребу, дистрибуцију и репродукцију у било ком медијуму, све док коначна употреба није у комерцијалне сврхе и док је претпоставка да је оригинално дело исправно. Референца.
Напомена: Молимо вас да наведете своју адресу е-поште само да би особа коју препоручујете страници знала да желите да види имејл и да то није спам. Нећемо бележити никакве адресе е-поште.
Ово питање се користи да се провери да ли сте посетилац и спречи аутоматско слање спама.
Аутори Е. Мотори, И. Атанасов, СМВ Коцхан, К. Фолз-Донахуе, В. Сактхивелу, П. Гиавалисцо, Н. Тони, Ј. Пуиал, Н.-Г. Ларсон
Протеомска анализа дисфункционалних неурона открила је да се метаболички програми активирају како би се супротставили неуродегенерацији.
Аутори Е. Мотори, И. Атанасов, СМВ Коцхан, К. Фолз-Донахуе, В. Сактхивелу, П. Гиавалисцо, Н. Тони, Ј. Пуиал, Н.-Г. Ларсон
Протеомска анализа дисфункционалних неурона открила је да се метаболички програми активирају како би се супротставили неуродегенерацији.
©2020 Америчко удружење за унапређење науке. сва права задржана. АААС је партнер ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ЦХОРУС, ЦЛОЦКСС, ЦроссРеф и ЦОУНТЕР. СциенцеАдванцес ИССН 2375-2548.