Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену CSS подршку. За најбоље резултате, препоручујемо вам да користите новију верзију прегледача (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказујемо сајт без стилизовања или JavaScript-а.
Пропионска киселина (ППА) се користи за проучавање улоге митохондријалне дисфункције у неуроразвојним поремећајима као што је поремећај из аутистичног спектра. Познато је да ППА ремети митохондријалну биогенезу, метаболизам и промет. Међутим, ефекти ППА на митохондријалну динамику, фисију и фузију остају проблематични због сложене временске природе ових механизама. Овде користимо комплементарне квантитативне технике снимања да бисмо истражили како ППА утиче на митохондријалну ултраструктуру, морфологију и динамику у неуронима сличним SH-SY5Y ћелијама. ППА (5 mM) је изазвала значајно смањење митохондријалне површине (p < 0,01), пречника и обима Ферета (p < 0,05) и површине 2 (p < 0,01). Анализа локатора митохондријалних догађаја показала је значајно повећање (p < 0,05) догађаја фисије и фузије, чиме се одржава интегритет митохондријалне мреже у стресним условима. Поред тога, експресија мРНК cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) и OPA1 (p < 0,05) је значајно смањена. 01). Ово илуструје ремоделирање митохондријалне морфологије, биогенезе и динамике како би се одржала функција у стресним условима. Наши подаци пружају нови увид у ефекте PPA на митохондријалну динамику и истичу корисност техника снимања за проучавање сложених регулаторних механизама укључених у митохондријалне одговоре на стрес.
Митохондрије су саставни учесници у разним ћелијским функцијама, поред њихових типичних улога у производњи енергије и биосинтези. Метаболизам митохондрија је кључни регулатор калцијумске сигнализације, метаболичке и редокс хомеостазе, инфламаторне сигнализације, епигенетских модификација, ћелијске пролиферације, диференцијације и програмиране ћелијске смрти1. Посебно је митохондријални метаболизам критичан за развој, преживљавање и функцију неурона и широко је укључен у различите манифестације неуропатологије2,3,4.
Током протекле деценије, метаболички статус се појавио као централни регулатор неурогенезе, диференцијације, сазревања и пластичности5,6. Недавно су митохондријална морфологија и динамика постале посебно важне компоненте митозе, динамичког процеса који одржава пул здравих митохондрија унутар ћелија. Митохондријална динамика је регулисана сложеним међусобно зависним путевима, од митохондријалне биогенезе и биоенергетике до митохондријалне фисије, фузије, транспорта и клиренса7,8. Поремећај било ког од ових интегративних механизама нарушава одржавање здравих митохондријалних мрежа и има дубоке функционалне последице по неуроразвој9,10. Заиста, дисрегулација митохондријалне динамике се примећује код многих психијатријских, неуродегенеративних и неуроразвојних поремећаја, укључујући поремећаје из аутистичног спектра (ПАС)11,12.
АСР је хетерогени неуроразвојни поремећај са сложеном генетском и епигенетском архитектуром. Наследност АСР-а је неоспорна, али основна молекуларна етиологија остаје слабо схваћена. Акумулирани подаци из преклиничких модела, клиничких студија и мулти-омичких молекуларних скупова података пружају све више доказа о митохондријалној дисфункцији код АСР-а13,14. Претходно смо извршили скрининг метилације ДНК на нивоу целог генома у кохорти пацијената са АСР-ом и идентификовали диференцијално метиловане гене груписане дуж митохондријалних метаболичких путева15. Накнадно смо известили о диференцијалној метилацији централних регулатора митохондријалне биогенезе и динамике, што је било повезано са повећаним бројем копија мтДНК и измењеним метаболичким профилом урина код АСР-а16. Наши подаци пружају све више доказа да митохондријална динамика и хомеостаза играју централну улогу у патофизиологији АСР-а. Стога је побољшање механистичког разумевања односа између митохондријалне динамике, морфологије и функције кључни циљ текућег истраживања неуролошких болести које карактерише секундарна митохондријална дисфункција.
Молекуларне технике се често користе за проучавање улоге специфичних гена у митохондријалним стресним одговорима. Међутим, овај приступ може бити ограничен вишеслојном и временском природом механизама митотске контроле. Штавише, диференцијална експресија митохондријалних гена је индиректни показатељ функционалних промена, посебно зато што се обично анализира само ограничен број гена. Стога су предложене директније методе за проучавање митохондријалне функције и биоенергетике17. Митохондријална морфологија је уско повезана са митохондријалном динамиком. Облик, повезаност и структура митохондрија су критични за производњу енергије и преживљавање митохондрија и ћелија5,18. Штавише, различите компоненте митозе фокусирају се на промене у митохондријалној морфологији, што може послужити као корисне крајње тачке митохондријалне дисфункције и пружити основу за накнадне механистичке студије.
Митохондријална морфологија се може директно посматрати помоћу трансмисионе електронске микроскопије (ТЕМ), што омогућава детаљно проучавање ћелијске ултраструктуре. ТЕМ директно визуализује морфологију, облик и структуру митохондријалних криста при резолуцији појединачних митохондрија, уместо да се ослања искључиво на транскрипцију гена, експресију протеина или параметре функционалности митохондрија у ћелијским популацијама17,19,20. Поред тога, ТЕМ олакшава проучавање интеракција између митохондрија и других органела, као што су ендоплазматски ретикулум и аутофагозоми, који играју кључну улогу у митохондријалној функцији и хомеостази21,22. Стога, ТЕМ чини добром полазном тачком за проучавање митохондријалне дисфункције пре фокусирања на специфичне путеве или гене. Како митохондријална функција постаје све релевантнија за неуропатологију, постоји јасна потреба да се буде у могућности да се директно и квантитативно проучава митохондријална морфологија и динамика у in vitro неуронским моделима.
У овом чланку испитујемо динамику митохондрија у неуронском моделу митохондријалне дисфункције код поремећаја из аутистичног спектра. Раније смо известили о диференцијалној метилацији пропионил-CoA карбоксилазе бета (PCCB) у ASD15, подјединици митохондријалног пропионил-CoA карбоксилазног ензима PCC. Познато је да дисрегулација PCC изазива токсичну акумулацију пропионил деривата, укључујући пропионску киселину (PPA)23,24,25. Показано је да PPA ремети неуронски метаболизам и мења понашање in vivo и представља успостављени животињски модел за проучавање неуроразвојних механизама укључених у ASD26,27,28. Поред тога, објављено је да PPA ремети потенцијал митохондријалне мембране, биогенезу и дисање in vitro и широко се користи за моделирање митохондријалне дисфункције у неуронима29,30. Међутим, утицај митохондријалне дисфункције изазване PPA на морфологију и динамику митохондрија остаје слабо схваћен.
Ова студија користи комплементарне технике снимања како би квантификовала ефекте PPA на митохондријалну морфологију, динамику и функцију у SH-SY5Y ћелијама. Прво, развили смо TEM метод за визуелизацију промена у митохондријалној морфологији и ултраструктури17,31,32. С обзиром на динамичку природу митохондрија33, такође смо користили анализу локализатора митохондријалних догађаја (MEL) како бисмо квантификовали промене у равнотежи између догађаја фисије и фузије, броја и запремине митохондрија под PPA стресом. Коначно, испитали смо да ли су митохондријална морфологија и динамика повезане са променама у експресији гена укључених у биогенезу, фисију и фузију. Узети заједно, наши подаци илуструју изазов разјашњавања сложености механизама који регулишу митохондријалну динамику. Истичемо корисност TEM-а у проучавању митохондријалне морфологије као мерљиве конвергентне крајње тачке митозе у SH-SY5Y ћелијама. Поред тога, истичемо да TEM подаци пружају најбогатије информације када се комбинују са техникама снимања које такође бележе динамичке догађаје као одговор на метаболички стрес. Даља карактеризација молекуларних регулаторних механизама који подржавају митозу неуронских ћелија може пружити важан увид у митохондријалну компоненту нервног система и неуродегенеративне болести.
Да би се индуковао митохондријални стрес, ћелије SH-SY5Y су третиране са PPA користећи 3 mM и 5 mM натријум пропионат (NaP). Пре TEM-а, узорци су подвргнути криогеној припреми узорака коришћењем замрзавања под високим притиском и замрзавања (Сл. 1а). Развили смо аутоматизовани цевовод за анализу митохондријалних слика како бисмо измерили осам морфолошких параметара митохондријалних популација у три биолошка понављања. Открили смо да је третман PPA значајно променио четири параметра: површину 2, површину, обим и Феретов пречник (Сл. 1б–е). Површина 2 се значајно смањила и са третманом PPA од 3 mM и са 5 mM (p = 0,0183 и p = 0,002, респективно) (Сл. 1б), док су се површина (p = 0,003), обим (p = 0,0106) и Феретов пречник значајно смањили. Дошло је до значајног смањења (p = 0,0172) у групи третираној са 5 mM у поређењу са контролном групом (Сл. 1ц–е). Значајна смањења површине и обима показала су да ћелије третиране са 5 mM PPA имају мање, заобљеније митохондрије и да су ове митохондрије мање издужене од оних у контролним ћелијама. Ово је такође у складу са значајним смањењем Феретовог пречника, независног параметра који указује на смањење највећег растојања између ивица честица. Примећене су промене у ултраструктури криста: кристе су постале мање изражене под утицајем PPA стреса (Сл. 1а, панел Б). Међутим, нису све слике јасно одражавале ултраструктуру криста, тако да квантитативна анализа ових промена није спроведена. Ови TEM подаци могу одражавати три могућа сценарија: (1) PPA појачава фисију или инхибира фузију, узрокујући смањење величине постојећих митохондрија; (2) побољшана биогенеза ствара нове, мање митохондрије или (3) истовремено индукује оба механизма. Иако се ови услови не могу разликовати помоћу TEM-а, значајне морфолошке промене указују на промене у митохондријалној хомеостази и динамици под PPA стресом. Накнадно смо истражили додатне параметре како бисмо даље окарактерисали ову динамику и потенцијалне механизме који леже у њеној основи.
Пропионска киселина (ППА) ремоделира морфологију митохондрија. (а) Репрезентативне слике трансмисионе електронске микроскопије (ТЕМ) које показују да се величина митохондрија смањује, а митохондрије постају мање и заобљеније са повећањем третмана ППА; 0 mM (нетретирано), 3 mM и 5 mM, респективно. Црвене стрелице означавају митохондрије. (б–е) SH-SY5Y ћелије третиране ППА током 24 сата су припремљене за ТЕМ, а резултати су анализирани помоћу Fiji/ImageJ. Четири од осам параметара показала су значајне разлике између контролних (нетретираних, 0 mM ППА) и третираних (3 mM и 5 mM ППА) ћелија. (б) Регион 2, (ц) Површина, (д) ​​Периметар, (е) Феретов пречник. Једносмерна анализа варијансе (контрола наспрам третмана) и Данетов тест вишеструког поређења коришћени су за одређивање значајних разлика (p < 0,05). Тачке података представљају просечну вредност митохондрија за сваку појединачну ћелију, а траке грешака представљају средњу вредност ± SEM. Приказани подаци представљају n = 3, најмање 24 ћелије по реплици; укупно је анализирано 266 слика; * означава p < 0,05, ** означава p < 0,01.
Да бисмо даље окарактерисали како митохондријална динамика реагује на PPA, обојили смо митохондрије тетраметилродамин етил естром (TMRE) и користили микроскопију са временским интервалом и MEL анализу да бисмо локализовали и квантификовали митохондрије након 24 сата на 3 и 5 mM PPA. Третман догађаја фисије и фузије. (Слика 2а). Након MEL анализе, митохондрије су даље анализиране да би се квантификовао број митохондријалних структура и њихова просечна запремина. Уочили смо мало, али значајно повећање броја догађаја фисије који се јављају на 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] у поређењу са догађајима фисије [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] и фузије [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (0,05)] <0,05)], а број догађаја фузије [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] <0,05)] је значајно повећан на 5 mM у поређењу са контролом (Слика 3б). Број митохондрија се значајно повећао и на 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] и на 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Сл. 3ц), док је просечна запремина сваке митохондријалне структуре остала непромењена (Сл. 3ц). 3д). Узето заједно, ово сугерише да ремоделирање митохондријалне динамике служи као компензаторни одговор који успешно одржава интегритет митохондријалне мреже. Повећање броја фисионих догађаја на 3 mM PPA сугерише да је повећање броја митохондрија делимично последица митохондријалне фисије, али с обзиром на то да просечна митохондријална запремина остаје у суштини непромењена, биогенеза се не може искључити као додатни компензаторни одговор. Међутим, ови подаци су у складу са мањим, округлим митохондријалним структурама које је примећено TEM-ом и такође показују значајне промене у митохондријалној динамици изазване PPA.
Пропионска киселина (PPA) индукује динамичко митохондријално ремоделирање како би се одржао интегритет мреже. SH-SY5Y ћелије су култивисане, третиране са 3 и 5 mM PPA током 24 сата и обојене са TMRE и Hoechst 33342, након чега је уследила MEL анализа. (а) Репрезентативне слике микроскопије са убрзаним снимком које приказују боју и бинаризоване пројекције максималног интензитета у времену 2 (t2) за свако стање. Одабрани региони назначени на свакој бинарној слици су побољшани и приказани у 3D у три различита временска оквира (t1-t3) како би се илустровала динамика током времена; догађаји фузије су истакнути зеленом бојом; догађаји фисије су истакнути зеленом бојом. Приказано црвеном бојом. (б) Просечан број динамичких догађаја по стању. (ц) Просечан број митохондријалних структура по ћелији. (д) Просечна запремина (µm3) сваке митохондријалне структуре по ћелији. Приказани подаци су репрезентативни за n = 15 ћелија по групи третмана. Приказане грешке представљају средњу вредност ± SEM, скала = 10 μm, * p < 0,05.
Пропионска киселина (PPA) изазива транскрипциону супресију гена повезаних са митохондријалном динамиком. SH-SY5Y ћелије су третиране са 3 и 5 mM PPA током 24 сата. Релативна квантификација гена је извршена коришћењем RT-qPCR и нормализована на B2M. Гени митохондријалне биогенезе (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 и (d) NFE2L2. Гени митохондријалне фузије и фисије (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 и (i) DRP1. Значајне разлике (p < 0,05) су тестиране коришћењем једносмерне ANOVA (контрола наспрам третмана) и Данетовог теста вишеструког поређења: * означава p < 0,05, ** означава p < 0,01, а **** означава p < 0,0001. Стубићи представљају средњу експресију ± SEM. Приказани подаци представљају n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) и n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) биолошких репликата.
Подаци из TEM и MEL анализа заједно указују да PPA мења морфологију и динамику митохондрија. Међутим, ове технике снимања не пружају увид у основне механизме који покрећу ове процесе. Стога смо испитали експресију мРНК девет кључних регулатора митохондријалне динамике, биогенезе и митозе као одговор на третман PPA. Квантификовали смо онкоген ћелијског мијелома (cMYC), нуклеарни респираторни фактор (NRF1), митохондријални транскрипциони фактор 1 (TFAM), NFE2-сличан транскрипциони фактор BZIP (NFE2L2), гастрину сличан протеин 2 (STOML2), атрофију оптичког нерва 1 (OPA1), митофузин 1 (MFN1), митофузин 2 (MFN2) и протеин 1 повезан са динамином (DRP1) након 24 сата третмана са 3 mM и 5 mM PPA. Приметили смо третман са 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 и p < 0,0001, респективно) и 5 ​​mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA (Сл. 3a–c). Смањење експресије mRNA било је зависно од дозе: експресија cMYC, NRF1 и TFAM се смањила за 5,7, 2,6 и 1,9 пута при 3 mM, респективно, и за 11,2, 3 и 2,2 пута при 5 mM. Насупрот томе, централни ген редокс биогенезе NFE2L2 није измењен ни при једној концентрацији PPA, иако је примећен сличан тренд смањене експресије зависан од дозе (Сл. 3d).
Такође смо испитали експресију класичних гена укључених у регулацију фисије и фузије. Сматра се да је STOML2 укључен у фузију, митофагију и биогенезу, а његова експресија је значајно смањена (p < 0,0001) за 3 mM (промена од 2,4 пута) и 5 ​​mM (промена од 2,8 пута) PPA (Сл. 1). 3д). Слично томе, експресија фузионог гена OPA1 је смањена при 3 mM (промена од 1,6 пута) и 5 ​​mM (промена од 1,9 пута) PPA (p = 0,006 и p = 0,0024, респективно) (Сл. 3ф). Међутим, нисмо пронашли значајне разлике у експресији фузионих гена MFN1, MFN2 или фисионог гена DRP1 под 24-часовним PPA стресом (Сл. 3г–и). Поред тога, открили смо да се нивои четири фузиона и фисиона протеина (OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1) нису променили под истим условима (Сл. 4a–d). Важно је напоменути да ови подаци одражавају једну временску тачку и можда не одражавају промене у експресији протеина или нивоима активности током раних фаза PPA стреса. Међутим, значајна смањења експресије cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 и OPA1 указују на значајну транскрипциону дисрегулацију митохондријалног метаболизма, биогенезе и динамике. Поред тога, ови подаци истичу корисност техника снимања за директно проучавање промена крајњег стања митохондријалне функције.
Нивои протеина фузије и фисионог фактора нису се променили након третмана пропионском киселином (PPA). SH-SY5Y ћелије су третиране са 3 и 5 mM PPA током 24 сата. Нивои протеина су квантификовани Western blot анализом, а нивои експресије су нормализовани на укупни протеин. Приказана је просечна експресија протеина и репрезентативни Western blot резултати циљног и укупног протеина. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Стубићи представљају средњу вредност ± SEM, а приказани подаци су репрезентативни за n = 3 биолошка поновљена уноса. Вишеструка поређења (p < 0,05) су извршена коришћењем једносмерне анализе варијансе и Данетовог теста. Оригинални гел и blot су приказани на слици S1.
Митохондријална дисфункција је повезана са мултисистемским болестима, од метаболичких, кардиоваскуларних и мишићних болести до неуролошких болести1,10. Многе неуродегенеративне и неуродегенеративне болести су повезане са митохондријалном дисфункцијом, што истиче важност ових органела током целог животног века мозга. Ове болести укључују Паркинсонову болест, Алцхајмерову болест и поремећај аутистичног спектра3,4,18. Међутим, приступ можданом ткиву за проучавање ових болести је тежак, посебно на механистичком нивоу, што чини ћелијске модел системе неопходном алтернативом. У овој студији, користимо ћелијски модел систем користећи ћелијске SH-SY5Y ћелије третиране PPA-ом да бисмо рекапитулирали митохондријалну дисфункцију примећену код неуронских болести, посебно поремећаја из аутистичног спектра. Коришћење овог PPA модела за проучавање митохондријалне динамике у неуронима може пружити увид у етиологију ASD-а.
Истражили смо могућност коришћења ТЕМ-а за посматрање промена у митохондријалној морфологији. Важно је напоменути да се ТЕМ мора правилно користити како би се максимизирала његова ефикасност. Припрема крио-узорака омогућава боље очување неуронских структура истовременим фиксирањем ћелијских компоненти и смањењем формирања артефаката34. У складу са тим, приметили смо да ћелије SH-SY5Y, сличне неуронима, имају нетакнуте субћелијске органеле и издужене митохондрије (Сл. 1а). Ово истиче корисност криогених техника припреме за проучавање митохондријалне морфологије у моделима неуронских ћелија. Иако су квантитативна мерења критична за објективну анализу ТЕМ података, још увек не постоји консензус о томе које специфичне параметре треба мерити да би се потврдиле митохондријалне морфолошке промене. На основу великог броја студија које су квантитативно испитивале митохондријалну морфологију17,31,32, развили смо аутоматизовани цевовод за анализу митохондријалне слике који мери осам морфолошких параметара, наиме: површину, површину2, однос ширине и висине, обим, кружност, степен , Фереов пречник и округлост.
Међу њима, PPA је значајно смањио површину 2, површину, периметар и Феретов пречник (Сл. 1б–е). Ово је показало да су митохондрије постале мање и заобљеније, што је у складу са претходним студијама које су показале смањење површине митохондрија након 72 сата митохондријалног стреса изазваног PPA30. Ове морфолошке карактеристике могу указивати на митохондријалну фисију, неопходан процес за секвестрирање оштећених компоненти из митохондријалне мреже како би се подстакла њихова разградња путем митофагије35,36,37. С друге стране, смањење просечне величине митохондрија може бити повезано са повећаном биогенезом, што резултира формирањем малих насцентних митохондрија. Повећана фисија или биогенеза представља компензаторни одговор за одржавање митозе у односу на митохондријални стрес. Међутим, смањен раст митохондрија, оштећена фузија или друга стања се не могу искључити.
Иако слике високе резолуције креиране ТЕМ-ом омогућавају одређивање морфолошких карактеристика на нивоу појединачних митохондрија, ова метода производи дводимензионалне снимке у једном тренутку. Да бисмо проучили динамичке одговоре на метаболички стрес, обојили смо митохондрије помоћу TMRE и користили микроскопију са временским интервалом са MEL анализом, која омогућава високопропусну 3Д визуелизацију промена у митохондријалној мрежи током времена33,38. Уочили смо суптилне, али значајне промене у динамици митохондрија под PPA стресом (Сл. 2). При 3 mM, број догађаја фисије се значајно повећао, док су догађаји фузије остали исти као у контроли. Повећање броја и догађаја фисије и фузије је примећено при 5 mM PPA, али су ове промене биле приближно пропорционалне, што сугерише да кинетика фисије и фузије достиже равнотежу при вишим концентрацијама (Сл. 2б). Просечна запремина митохондрија остала је непромењена и при 3 и при 5 mM PPA, што указује да је интегритет митохондријалне мреже очуван (Сл. 2д). Ово одражава способност динамичких митохондријалних мрежа да реагују на благи метаболички стрес како би ефикасно одржавале хомеостазу без изазивања фрагментације мреже. Код 3 мМ ППА, повећање фисије је довољно да подстакне прелазак на нову равнотежу, али је потребно дубље кинетичко ремоделирање као одговор на стрес изазван вишим концентрацијама ППА.
Број митохондрија се повећао при обе концентрације стреса ППА, али се просечна запремина митохондрија није значајно променила (Сл. 2ц). То може бити последица повећане биогенезе или повећане деобе; међутим, у одсуству значајног смањења средње запремине митохондрија, вероватније је да се биосинтеза повећава. Међутим, подаци на Слици 2 подржавају постојање два компензациона механизма: повећање броја догађаја фисије, што је у складу са повећањем митохондријалне фисије, и повећање броја догађаја, што је у складу са митохондријалном биогенезом. У крајњој линији, динамичка компензација за благи стрес може се састојати од истовремених процеса који укључују фисију, фузију, биогенезу и митофагију. Иако су претходни аутори показали да ППА појачава митозу30,39 и митофагију29, ми пружамо доказе за ремоделирање динамике митохондријалне фисије и фузије као одговор на ППА. Ови подаци потврђују морфолошке промене примећене ТЕМ-ом и пружају даљи увид у механизме повезане са митохондријалном дисфункцијом изазваном ППА.
Пошто ни ТЕМ ни МЕЛ анализа нису пружиле директне доказе о механизмима генске регулације који леже у основи уочених морфолошких промена, испитали смо РНК експресију гена укључених у митохондријални метаболизам, биогенезу и динамику. cMYC прото-онкоген је транскрипциони фактор укључен у регулацију митохондрија, гликолизе, метаболизма аминокиселина и масних киселина40. Поред тога, познато је да cMYC регулише експресију скоро 600 митохондријалних гена укључених у митохондријалну транскрипцију, транслацију и склапање комплекса, укључујући NRF1 и TFAM41. NRF1 и TFAM су два централна регулатора митозе, који делују низводно од PGC-1α да би активирали репликацију мтДНК. Овај пут се активира цАМП и АМПК сигнализацијом и осетљив је на потрошњу енергије и метаболички стрес. Такође смо испитали NFE2L2, редокс регулатор митохондријалне биогенезе, како бисмо утврдили да ли ефекти PPA могу бити посредовани оксидативним стресом.
Иако је експресија NFE2L2 остала непромењена, пронашли смо конзистентно смањење експресије cMYC, NRF1 и TFAM зависно од дозе након 24 сата третмана са 3 mM и 5 mM PPA (Сл. 3a–c). Смањење експресије cMYC је раније пријављено као одговор на митохондријални стрес42, и обрнуто, смањење експресије cMYC може изазвати митохондријалну дисфункцију ремоделирањем митохондријалног метаболизма, мрежне повезаности и мембранске поларизације43. Занимљиво је да је cMYC такође укључен у регулацију митохондријалне фисије и фузије42,43 и познато је да повећава фосфорилацију DRP1 и митохондријалну локализацију током ћелијске деобе44, као и да посредује у митохондријалном морфолошком ремоделирању у неуронским матичним ћелијама45. Заиста, фибробласти са недостатком cMYC показују смањену величину митохондрија, што је у складу са променама изазваним стресом PPA43. Ови подаци илуструју занимљиву, али још увек нејасну везу између cMYC и митохондријалне динамике, пружајући занимљиву мету за будуће студије ремоделирања изазваног стресом PPA.
Смањење NRF1 и TFAM је у складу са улогом cMYC као важног транскрипционог активатора. Ови подаци су такође у складу са претходним студијама на ћелијама рака дебелог црева код људи које показују да је PPA смањио експресију NRF1 mRNA након 22 сата, што је било повезано са исцрпљивањем ATP-а и повећањем ROS46. Ови аутори су такође известили да се експресија TFAM повећала након 8,5 сати, али се вратила на почетне нивое након 22 сата. Насупрот томе, Kim et al. (2019) су показали да је експресија TFAM mRNA значајно смањена након 4 сата PPA стреса у SH-SY5Y ћелијама; међутим, након 72 сата, експресија TFAM протеина је значајно повећана, а број копија mtDNA је значајно повећан. Дакле, смањење броја гена митохондријалне биогенезе које смо приметили након 24 сата не искључује могућност да је повећање броја митохондрија повезано са активацијом биогенезе у ранијим временским тачкама. Претходне студије су показале да PPA значајно повећава регулацију PGC-1α иРНК и протеина у SH-SY5Y ћелијама након 4 сата и 30 минута, док пропионска киселина појачава митохондријалну биогенезу у хепатоцитима телади путем PGC-1α након 12 сати и 39 минута. Занимљиво је да PGC-1α није само директан транскрипциони регулатор NRF1 и TFAM, већ је показано да регулише и активност MFN2 и DRP1 регулисањем фисије и фузије47. Узето заједно, ово истиче блиску повезаност механизама који регулишу митохондријалне компензаторне одговоре изазване PPA. Штавише, наши подаци одражавају значајну дисрегулацију транскрипционе регулације биогенезе и метаболизма под стресом PPA.
Гени STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1 су међу централним регулаторима митохондријалне фисије, фузије и динамике37,48,49. Постоји много других гена укључених у митохондријалну динамику, међутим, раније је утврђено да су STOML2, OPA1 и MFN2 диференцијално метилирани у кохортама са аутизмом16, а неколико независних студија је пријавило промене у овим транскрипционим факторима као одговор на митохондријални стрес50,51.52. Експресија и OPA1 и STOML2 је значајно смањена третманом са 3 mM и 5 mM PPA (Сл. 3е, ф). OPA1 је један од класичних регулатора митохондријалне фузије кроз директну интеракцију са MFN1 и 2 и игра улогу у ремоделирању криста и митохондријалној морфологији53. Прецизна улога STOML2 у митохондријалној динамици остаје нејасна, али докази указују на то да игра улогу у митохондријалној фузији, биогенези и митофагији.
STOML2 је укључен у одржавање митохондријалног респираторног спрезања и формирање комплекса респираторних ланаца54,55 и показано је да дубоко мења метаболичке карактеристике ћелија рака56. Студије су показале да STOML2 промовише потенцијал митохондријалне мембране и биогенезу кроз интеракцију са BAN и кардиолипином 55, 57, 58. Поред тога, независне студије су показале да интеракција између STOML2 и PINK1 регулише митофагију59,60. Приметно је да је објављено да STOML2 директно интерагује са MFN2 и стабилизује га, а такође игра важну улогу у стабилизацији дугих OPA1 изоформи инхибирањем протеазе одговорне за деградацију OPA153,61,62. Смањење експресије STOML2 примећено у PPA реакцијама може учинити ове фузионе протеине подложнијим деградацији кроз убиквитин- и протеазома-зависне путеве48. Иако прецизна улога STOML2 и OPA1 у динамичком одговору на PPA није јасна, смањена експресија ових фузионих гена (Слика 3) може пореметити равнотежу између фисије и фузије и довести до смањења величине митохондрија (Слика 3). 1).
С друге стране, експресија протеина OPA1 остала је непромењена након 24 сата, док се нивои mRNA и протеина MFN1, MFN2 или DRP1 нису значајно променили након третмана PPA (Сл. 3g-i, Сл. 4). Ово може указивати на то да нема промена у регулацији ових фактора укључених у митохондријалну фузију и фисију. Међутим, вреди напоменути да је сваки од ова четири гена такође регулисан посттранскрипционим модификацијама (PTM) које контролишу активност протеина. OPA1 има осам алтернативних варијанти сплајсовања које се протеолитички цепају у митохондријама да би се произвеле две различите изоформе 63. Равнотежа између дугих и кратких изоформи на крају одређује улогу OPA1 у митохондријалној фузији и одржавању митохондријалне мреже64. Активност DRP1 регулише фосфорилација протеин киназе II зависне од калцијума/калмодулина (CaMKII), док је деградација DRP1 регулисана убиквитимацијом и SUMOилацијом65. Коначно, и DRP1 и MFN1/2 су ГТПазе, тако да на активност може утицати брзина производње ГТП-а у митохондријама 66. Стога, иако експресија ових протеина остаје константна, ово можда не одражава непромењену активност или локализацију протеина 67,68. Заиста, постојећи репертоари ПТМ протеина често служе као прва линија одбране одговорна за посредовање у акутним стресним одговорима. У присуству умереног метаболичког стреса у нашем моделу, вероватно је да ПТМ промовише повећану активност фузионих и фисионих протеина како би се довољно обновио интегритет митохондрија без потребе за додатном активацијом ових гена на нивоу иРНК или протеина.
Узети заједно, горе наведени подаци истичу сложену и временски зависну регулацију митохондријалне морфологије и изазове разјашњавања ових механизама. Да би се проучила експресија гена, прво је потребно идентификовати специфичне циљне гене у путањи. Међутим, наши подаци показују да гени у истом путу не реагују на исти начин на исти стрес. Заправо, претходне студије су показале да различити гени у истом путу могу показивати различите временске профиле одговора30,46. Поред тога, постоје сложени пост-транскрипциони механизми који нарушавају везу између транскрипције и функције гена. Протеомске студије могу пружити увид у утицај ПТМ-ова и функције протеина, али оне такође представљају изазове, укључујући методе ниског протока, висок однос сигнал-шум и лошу резолуцију.
У овом контексту, проучавање митохондријалне морфологије коришћењем ТЕМ-а и МЕЛ-а има велики потенцијал да се позабави фундаменталним питањима о односу између митохондријалне динамике и функције и како то утиче на болест. Најважније је да ТЕМ пружа директан метод за мерење митохондријалне морфологије као конвергентне крајње тачке митохондријалне дисфункције и динамике51. МЕЛ такође пружа директан метод за визуелизацију догађаја фисије и фузије у тродимензионалном ћелијском окружењу, омогућавајући квантификацију динамичког митохондријалног ремоделирања чак и у одсуству промена у експресији гена33. Овде истичемо корисност техника митохондријалног снимања код секундарних митохондријалних болести. Ове болести се обично карактеришу хроничним благим метаболичким стресом који карактерише суптилно ремоделирање митохондријалних мрежа, а не акутним митохондријалним оштећењем. Међутим, митохондријална компензација потребна за одржавање митозе под хроничним стресом има дубоке функционалне последице. У контексту неуронауке, боље разумевање ових компензационих механизама може пружити важне информације о плеиотропној неуропатологији повезаној са митохондријалном дисфункцијом.
Коначно, наши подаци истичу корисност техника снимања за разумевање функционалних последица сложених интеракција између експресије гена, модификација протеина и активности протеина које контролишу динамику неуронских митохондрија. Користили смо PPA за моделирање митохондријалне дисфункције у моделу неуронских ћелија како бисмо стекли увид у митохондријалну компоненту ASD-а. SH-SY5Y ћелије третиране са PPA показале су промене у митохондријалној морфологији: митохондрије су постале мале и округле, а кристе су биле слабо дефинисане када су посматране TEM-ом. MEL анализа показује да се ове промене јављају истовремено са повећањем догађаја фисије и фузије како би се одржала митохондријална мрежа као одговор на благи метаболички стрес. Штавише, PPA значајно ремети транскрипциону регулацију митохондријалног метаболизма и хомеостазе. Идентификовали смо cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 и OPA1 као кључне митохондријалне регулаторе поремећене PPA стресом и могу играти улогу у посредовању PPA-индукованих промена у митохондријалној морфологији и функцији. Потребна су будућа истраживања како би се боље окарактерисале PPA-индуковане временске промене у експресији гена и активности протеина, локализацији и посттранслационим модификацијама. Наши подаци истичу сложеност и међузависност регулаторних механизама који посредују у одговору митохондријалног стреса и показују корисност ТЕМ-а и других техника снимања за циљаније механистичке студије.
Ћелијска линија SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) је купљена од Sigma-Aldrich. SH-SY5Y ћелије су гајене у Дулбековом модификованом Игловом медијуму/F-12 хранљивој смеши (DMEM/F-12) и L-глутамину (SC09411, ScienCell) у бочицама од 25 cm² допуњеним са 20% феталног говеђег серума (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) и 1% пеницилин-стрептомицина (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) на 37 °C, 5% CO2. Ћелије су субкултивисане до 80% конфлуенције користећи 0,05% трипсин-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), центрифугиране на 300 g и посејане на густину од приближно 7 × 105 ћелија/ml. Сви експерименти су спроведени на недиференцираним SH-SY5Y ћелијама између пасажа 19–22. PPA се примењује као NaP. Растворити NaP прах (CAS бр. 137-40-6, хемијска формула C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) у топлој MilliQ води до концентрације од 1 M и чувати на 4 °C. На дан третмана, разблажити овај раствор са 1 M PPA до 3 mM и 5 mM PPA у медијуму без серума (DMEM/F-12 са L-глутамином). Концентрације третмана за све експерименте биле су без PPA (0 mM, контрола), 3 mM и 5 mM PPA. Експерименти су спроведени у најмање три биолошка понављања.
SH-SY5Y ћелије су посејане у боце од 25 cm5 брзином од 5,5 × 105 ћелија/ml и гајене 24 сата. PPA третман је додат у боцу пре 24 сата инкубације. Сакупите ћелијске пелете пратећи нормалне протоколе за субкултуру ткива сисара (описане горе). Ресуспендујте ћелијске пелете у 100 µl 2,5% глутаралдехида, 1× PBS и чувајте на 4 °C до обраде. SH-SY5Y ћелије су кратко центрифугиране да би се ћелије пелетирале и уклонило 2,5% глутаралдехида, 1× PBS раствора. Ресуспендујте седимент у 4% агарозном гелу припремљеном у дестилованој води (однос агарозе и запремине седимента је 1:1). Комади агарозе су постављени на решетке на равним плочама и пресвучени 1-хексадеценом пре замрзавања под високим притиском. Узорци су замрзнути у 100% сувом ацетону на -90°C током 24 сата. Температура је затим повишена на -80°C и додат је раствор од 1% осмијум тетроксида и 0,1% глутаралдехида. Узорци су чувани на -80°C током 24 сата. Након тога, температура је постепено повећавана до собне температуре током неколико дана: од –80°C до –50°C током 24 сата, до –30°C током 24 сата, до –10°C током 24 сата и коначно до собне температуре.
Након криогене припреме, узорци су импрегнирани смолом и направљени су ултратанки пресеци (∼100 nm) коришћењем ултрамикротома Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Пресеци су обојени са 2% уранил ацетата и олово цитрата. Узорци су посматрани коришћењем трансмисионог електронског микроскопа FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (раније FEI), Ајндховен, Холандија) који ради на 200 kV (Lab6 предајник) и Gatan CCD камере (Gatan, Велика Британија) опремљене Tridiem енергетским филтером.
У свакој техничкој реплицираности, снимљено је најмање 24 слике појединачних ћелија, што је укупно 266 слика. Све слике су анализиране коришћењем макроа региона интереса (ROI) и макроа митохондрија. Митохондријални макро је заснован на објављеним методама17,31,32 и омогућава полуаутоматску групну обраду TEM слика у Fiji/ImageJ69. Укратко: слика је инвертована и инвертована коришћењем одузимања позадине котрљајуће лоптице (радијус од 60 пиксела) и FFT филтера пропусног опсега (користећи горњу и доњу границу од 60 и 8 пиксела респективно) и супресије вертикалних линија са толеранцијом оријентације од 5%. Обрађена слика се аутоматски подешава на праг коришћењем алгоритма максималне ентропије и генерише се бинарна маска. Региони слике повезани са ручно одабраним ROI у сировим TEM сликама су екстраховани, карактеришући митохондрије и искључујући плазма мембрану и друге регионе са високим контрастом. За сваки екстраховани ROI, анализиране су бинарне честице веће од 600 пиксела, а површина честице, обим, главне и споредне осе, Фереов пречник, округлост и кружност су мерени коришћењем уграђених функција мерења Fiji/ImageJ. Пратећи Мерил, Флиппо и Страк (2017), површина 2, однос ширине и висине честице (однос главне и споредне осе) и фактор облика (FF) су израчунати из ових података, где је FF = обим 2/4π x површина. Дефиниција параметарске формуле може се наћи у Мерил, Флиппо и Страк (2017). Поменути макрои су доступни на GitHub-у (видети Изјаву о доступности података). У просеку, приближно 5.600 честица је анализирано по PPA третману, за укупно приближно 17.000 честица (подаци нису приказани).
SH-SH5Y ћелије су стављене у посуде за култивацију са 8 комора (ThermoFisher, #155411) ради адхезије преко ноћи, а затим су инкубиране са TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) и Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Слике су снимљене коришћењем ласера ​​од 405 nm и 561 nm током 10 минута, а сирове слике су снимљене као z-стекови који садрже 10 микрографија слика са az кораком од 0,2 μm између фрејмова слике у 12 узастопних временских тачака. Слике су прикупљене коришћењем Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 платформе супер-резолуције (Carl Zeiss, Oberkochen, Немачка) користећи LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 сочиво. Слике су анализиране у ImageJ-у коришћењем претходно описаног цевовода и ImageJ додатка за мерење догађаја фузије и фисије, просечног броја митохондријалних структура и просечне запремине митохондрија по ћелији33. MEL макрои су доступни на GitHub-у (видети Изјаву о доступности података).
SH-SY5Y ћелије су гајене у плочама са шест бунарића при густини од 0,3 × 10⁶ ћелија/mL током 24 сата пре третмана. РНК је екстрахована коришћењем Quick-RNA™ Miniprep протокола (ZR R1055, Zymo Research) са малим модификацијама: додајте 300 μl пуфера за лизу РНК у сваки бунар пре вађења и лизирајте сваки узорак као завршни корак са 30 μl воде без DNase/RNase елуције. Сви узорци су проверени на количину и квалитет коришћењем NanoDrop ND-1000 UV-Vis спектрофотометра. Укупни протеини из ћелијских лизата су добијени коришћењем 200 μl RIPA пуфера за лизу, а концентрација протеина је квантификована коришћењем Bradford протеинског теста70.
Синтеза цДНК је извршена коришћењем Tetro™ комплета за синтезу цДНК (BIO-65043, Meridian Bioscience) према упутствима произвођача, уз неке модификације. цДНК је синтетисана у реакцијама од 20 μl користећи 0,7 до 1 μg укупне РНК. Прајмери ​​су одабрани из претходно објављених радова 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Табела S1), а пратеће сонде су дизајниране коришћењем алата PrimerQuest компаније Integrated DNA Technologies. Сви гени од интереса су нормализовани на нуклеарни B2M ген. Експресија гена STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC и OPA1 је мерена RT-qPCR-ом. Мастер микс је укључивао LUNA Taq полимеразу (M3003L, New England Biolabs), 10 μM директне и реверзне прајмере, цДНК и воду PCR квалитета да би се добила коначна запремина од 10 μL за сваку реакцију. Експресија гена деобе и фисије (DRP1, MFN1/2) мерена је коришћењем TaqMan мултиплекс тестова. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) коришћен је према упутствима произвођача са мањим изменама. Мултиплекс RT-qPCR master mix укључује 1X LUNA Taq полимеразу, 10 μM директне и реверзне прајмере, 10 μM сонду, цДНК и воду PCR квалитета, што је резултирало коначном запремином од 20 μL за сваку реакцију. RT-qPCR је изведен коришћењем Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - серијски број: R0618110). Услови циклуса су приказани у Табели S1. Сви узорци цДНК су амплификовани у три примерка и стандардна крива је генерисана коришћењем серије десетоструких разблажења. Из анализе су уклоњени одступајући резултати у три примерка са стандардном девијацијом прага циклуса (Ct) >0,5 како би се осигурала репродуктивност података30,72. Релативна експресија гена је израчуната коришћењем 2-ΔΔCt79 методе.
Узорци протеина (60 μг) су помешани са Лемлијевим пуфером за пуњење у односу 2:1 и анализирани на 12% безбојном протеинском гелу (Bio-Rad #1610184). Протеини су пренети на PVDF (поливинилиден флуорид) мембрану (#170-84156, Bio-Rad) коришћењем Trans-Blot Turbo система (#170-4155, Bio-Rad). Мембрана је блокирана и инкубирана са одговарајућим примарним антителима (OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1) (разблажена 1:1000) током 48 сати, након чега је уследила инкубација са секундарним антителима (1:10.000) током 1 сата. Мембране су затим снимљене коришћењем Clarity Western ECL супстрата (#170-5061, Bio-Rad) и снимљене помоћу Bio-Rad ChemiDoc MP система. За Western blot анализу је коришћен ImageLab верзија 6.1. Оригинални гел и блот су приказани на слици S1. Информације о антителима су дате у табели S2.
Скупови података су представљени као средња вредност и стандардна грешка средње вредности (SEM) најмање три независна узорка. Скупови података су тестирани на нормалност коришћењем Шапиро-Вилксовог теста (осим ако није другачије назначено) пре него што се претпоставила Гаусова расподела и једнаке стандардне девијације и наставило са анализама. Поред тога, анализа скупа података је обављена коришћењем Фишеровог MEL LSD теста (p < 0,05), једносмерне ANOVA (средња вредност третмана у односу на контролу) и Данетовог теста вишеструког поређења ради одређивања значајности (p < 0,05). Значајне p вредности су приказане на графикону као *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Све статистичке анализе и графикони су извршени и генерисани коришћењем GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji/ImageJ макрои за анализу TEM слика су јавно доступни на GitHub-у: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Макро за локатор митохондријалних догађаја (MEL) је јавно доступан на GitHub-у: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Меилијана А., Деви НМ и Виџаја А. Митохондрије: главни регулатори метаболизма, хомеостазе, стреса, старења и епигенетике. Индонежански. Биомедицинске науке. Ј. 13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Вишеструка митохондријална дисфункција код шизофреније, комплекс I као могућа патолошка мета. Шизофренија. ресурс. 187, 3–10 (2017).
Бозе, А. и Бил, МФ Митохондријална дисфункција код Паркинсонове болести. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Шарма ВК, Синг ТГ и Мехта В. Стресиране митохондрије: мете инвазије код Алцхајмерове болести. Митохондрије 59, 48–57 (2021).
Беленгер П., Дуарте ЖМН, Шук ПФ и Фереира ГК Митохондрије и мозак: биоенергетика и још много тога. Неуротоксини. ресурс. 36, 219–238 (2019).
Рангарају, В. и др. Плеотропне митохондрије: утицај митохондрија на развој неурона и болести. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Кардањо-Рамос, К. и Мораис, В.А. Митохондријална биогенеза у неуронима: како и где. Интернационалност. Ј. Мор. Наука. 22, 13059 (2021).
Ју, Р., Лендал, У., Нистер, М. и Жао, Ј. Регулација митохондријалне динамике сисара: могућности и изазови. фронт. ендокрини. (Лозана) 11, 374 (2020).
Хачо, М. и Слек, Р.С. Митохондријална динамика у регулацији неурогенезе: од мозга у развоју до мозга одраслог доба. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).