Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да искључите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Наночестице инсулина (НЧ) са високим садржајем пуњења нашле су различите примене у различитим дозним облицима. Циљ овог рада је да се процени ефекат процеса лиофилизације и сушења распршивањем на структуру хитозанских наночестица пуних инсулином, са или без манитола као криопротектанта. Такође смо проценили квалитет ових наночестица њиховим поновним растварањем. Пре дехидрације, величина честица умрежених наночестица хитозана/натријум триполифосфата/инсулина је оптимизована на 318 nm, PDI је био 0,18, ефикасност енкапсулације је била 99,4%, а пуњење је било 25,01%. Након реконституције, све наночестице, осим оних произведених методом лиофилизације без употребе манитола, задржале су своју сферну структуру честица. У поређењу са наночестицама које садрже манитол дехидрираним било којим спрејом, наночестице сушене распршивањем без манитола такође су показале најмању средњу величину честица (376 nm) и највећи садржај пуњења (25,02%) са сличном стопом енкапсулације (98,7%) и PDI. (0,20) техникама сушења или лиофилизације. Осушене наночестице сушењем распршивањем без манитола такође су резултирале најбржим ослобађањем инсулина и највећом ефикасношћу ћелијског апсорпције. Овај рад показује да сушење распршивањем може дехидрирати наночестице инсулина без потребе за криопротектантима у поређењу са конвенционалним методама лиофилизације, стварајући већи капацитет пуњења, ниже потребе за адитивима и значајну предност у оперативним трошковима.
Од свог открића 1922. године1,2,3, инсулин и његови фармацеутски препарати спасили су животе пацијената са дијабетесом типа 1 (Т1ДМ) и дијабетесом типа 2 (Т1ДМ). Међутим, због својих својстава као протеина високе молекулске тежине, инсулин се лако агрегира, разлаже протеолитичким ензимима и елиминише ефектом првог пролаза. Људима којима је дијагностикован дијабетес типа 1 потребне су ињекције инсулина до краја живота. Многим пацијентима којима је првобитно дијагностикован дијабетес типа 2 такође су потребне дуготрајне ињекције инсулина. Дневне ињекције инсулина су озбиљан извор свакодневног бола и нелагодности за ове особе, са негативним ефектима на ментално здравље. Као резултат тога, други облици примене инсулина који изазивају мање нелагодности, као што је орална примена инсулина, опширно се проучавају5 јер имају потенцијал да обнове квалитет живота приближно 5 милијарди људи са дијабетесом широм света.
Технологија наночестица је обезбедила значајан напредак у покушајима узимања оралног инсулина4,6,7. Онај који ефикасно капсулира и штити инсулин од деградације ради циљане испоруке на одређена места на телу. Међутим, употреба формулација са наночестицама има неколико ограничења, углавном због проблема са стабилношћу суспензија честица. Може доћи до извесне агрегације током складиштења, што смањује биодоступност наночестица напуњених инсулином8. Поред тога, хемијска стабилност полимерне матрице наночестица и инсулина такође се мора узети у обзир како би се осигурала стабилност наночестица инсулина (НЧ). Тренутно је технологија лиофилизације златни стандард за стварање стабилних НЧ, уз спречавање нежељених промена током складиштења9.
Међутим, лиофилизација захтева додавање криопротектанта како би се спречило да сферна структура НЧ буде под утицајем механичког напрезања кристала леда. Ово значајно смањује оптерећење инсулинских наночестица након лиофилизације, јер криопротектант заузима највећи део тежинског односа. Стога се произведене инсулинске НЧ често сматрају непогодним за производњу сувих прашкастих формулација, као што су оралне таблете и орални филмови, због потребе за великим количинама сувих наночестица да би се постигао терапеутски прозор инсулина.
Сушење распршивањем је добро познат и јефтин процес индустријског обима за производњу сувих прахова из течних фаза у фармацеутској индустрији10,11. Контрола над процесом формирања честица омогућава правилно капсулирање неколико биоактивних једињења12,13. Штавише, постала је ефикасна техника за припрему енкапсулираних протеина за оралну примену. Током сушења распршивањем, вода веома брзо испарава, што помаже у одржавању ниске температуре језгра честице11,14, омогућавајући њену примену за енкапсулирање компоненти осетљивих на топлоту. Пре сушења распршивањем, материјал за премаз треба темељно хомогенизовати са раствором који садржи енкапсулиране састојке11,14. За разлику од лиофилизације, хомогенизација пре енкапсулације код сушења распршивањем побољшава ефикасност енкапсулације током дехидрације. Пошто процес енкапсулације сушењем распршивањем не захтева криопротектанте, сушење распршивањем се може користити за производњу сушених НП са високим садржајем пуњења.
Ова студија извештава о производњи наночестица напуњених инсулином умрежавањем хитозана и натријум триполифосфата коришћењем методе јонског гела. Јонска желатина је метода припреме која омогућава производњу наночестица путем електростатичких интеракција између две или више јонских врста под одређеним условима. За дехидратацију оптимизованих умрежених наночестица хитозана/натријум триполифосфата/инсулина коришћене су технике лиофилизације и сушења распршивањем. Након дехидрације, њихова морфологија је анализирана СЕМ-ом. Њихова способност рекомбинације је процењена мерењем њихове расподеле величине, површинског наелектрисања, PDI-ја, ефикасности енкапсулације и садржаја пуњења. Квалитет ресолубилизованих наночестица произведених различитим методама дехидрације такође је процењен поређењем њихове инсулинске заштите, понашања ослобађања и ефикасности ћелијског апсорпције.
pH вредност мешаног раствора и однос хитозана и инсулина су два кључна фактора која утичу на величину честица и ефикасност енкапсулације (ЕЕ) финалних НП, јер директно утичу на јонотропни процес желатинирања. Показало се да је pH вредност мешаног раствора у високој корелацији са величином честица и ефикасношћу енкапсулације (Сл. 1а). Као што је приказано на Сл. 1а, како се pH повећавао са 4,0 на 6,0, просечна величина честица (нм) се смањивала, а ЕЕ се значајно повећавала, док када се pH повећавао на 6,5, просечна величина честица је почела да се повећава, а ЕЕ је остајала непромењена. Како се однос хитозана и инсулина повећава, повећава се и просечна величина честица. Штавише, није примећена промена ЕЕ када су наночестице припремљене при масеном односу хитозана/инсулина већем од 2,5:1 (w/w) (Сл. 1б). Стога су оптимални услови припреме у овој студији (pH 6,0, масени однос хитозана/инсулина од 2,5:1) коришћени за припрему. наночестице напуњене инсулином за даља истраживања. Под овим условима припреме, просечна величина честица наночестица инсулина је оптимизована на 318 nm (Сл. 1c), PDI је био 0,18, ефикасност уграђивања је била 99,4%, зета потенцијал је био 9,8 mv, а оптерећење инсулином је било 25,01% (m/m). На основу резултата трансмисионе електронске микроскопије (ТЕМ), оптимизоване наночестице су биле приближно сферне и дискретне са релативно уједначеном величином (Сл. 1d).
Оптимизација параметара инсулинских наночестица: (а) утицај pH на средњи пречник и ефикасност енкапсулације (ЕЕ) инсулинских наночестица (припремљених при масеном односу хитозана и инсулина 5:1); (б) хитозан и утицај масеног односа инсулина на средњи пречник и ефикасност енкапсулације (ЕЕ) инсулинских НЧ (припремљених при pH 6); (ц) расподела величине честица оптимизованих инсулинских наночестица; (д) TEM микрографија оптимизованих инсулинских НЧ.
Добро је познато да је хитозан слаб полиелектролит са pKa од 6,5. Позитивно је наелектрисан у киселој средини јер је његова главна амино група протонирана водониковим јонима15. Стога се често користи као носач за енкапсулацију негативно наелектрисаних макромолекула. ​​У овој студији, хитозан је коришћен за енкапсулацију инсулина са изоелектричном тачком од 5,3. Пошто се хитозан користи као материјал за премаз, са повећањем његовог удела, дебљина спољашњег слоја наночестица се сходно томе повећава, што резултира већом просечном величином честица. Поред тога, већи нивои хитозана могу да енкапсулирају више инсулина. У нашем случају, ЕЕ је био највиши када је однос хитозана и инсулина достигао 2,5:1, и није било значајне промене у ЕЕ када се однос повећавао.
Поред односа хитозана и инсулина, pH вредност је такође играла кључну улогу у припреми НП. Ган и др.17 проучавали су утицај pH вредности на величину честица хитозанских наночестица. Открили су континуирано смањење величине честица све док pH вредност није достигла 6,0, а значајно повећање величине честица је примећено при pH вредности > 6,0, што је у складу са нашим запажањима. Овај феномен је последица чињенице да са повећањем pH вредности, молекул инсулина добија негативно површинско наелектрисање, што фаворизује електростатичке интеракције са комплексом хитозан/натријум триполифосфат (ТПП), што резултира малом величином честица и високом ЕЕ. Међутим, када је pH вредност подешена на 6,5, амино групе на хитозану су депротониране, што је резултирало савијањем хитозана. Дакле, висока pH вредност резултира мањом изложеношћу амино јона ТПП-у и инсулину, што резултира мањим умрежавањем, већом коначном просечном величином честица и нижом ЕЕ.
Анализа морфолошких својстава лиофилизованих и распршиваних наночестица може водити избор бољих техника дехидрације и формирања праха. Преферирана метода треба да обезбеди стабилност лека, уједначен облик честица, високо пуњење леком и добру растворљивост у оригиналном раствору. У овој студији, ради бољег упоређивања две технике, инсулинске наночестице са или без 1% манитола коришћене су током дехидрације. Манитол се користи као средство за повећање запремине или криопротектант у различитим формулацијама сувог праха за лиофилизацију и распршивање. Код лиофилизованих инсулинских наночестица без манитола, као што је приказано на слици 2а, примећена је високо порозна структура праха са великим, неправилним и храпавим површинама под скенирајућом електронском микроскопијом (СЕМ). Мало дискретних честица је детектовано у праху након дехидрације (слика 2е). Ови резултати су показали да је већина наночестица разложена током лиофилизације без икаквог криопротектанта. Код лиофилизованих и распршиваних инсулинских наночестица које садрже 1% манитола, примећене су сферне наночестице са глатким површинама (слика 2б, д, ф, х). Инсулинске наночестице сушене распршивањем без манитола остале су сферне, али... наборане на површини (Сл. 2ц). Сферне и наборане површине су даље размотрене у тестовима понашања при ослобађању и ћелијске апсорпције у наставку. На основу видљивог изгледа осушених НП, и НП сушене распршивањем без манитола и НП лиофилизоване и распршено сушене са манитолом дале су фине прахове НП (Сл. 2ф, г, х). Што је већа површина између површина честица, већа је растворљивост и самим тим већа је брзина ослобађања.
Морфологија различитих дехидрираних инсулинских наночестица: (а) СЕМ слика лиофилизованих инсулинских наночестица без манитола; (б) СЕМ слика лиофилизованих инсулинских наночестица са манитолом; (ц) инсулинске наночестице сушене распршивањем без манитола СЕМ слика ; (д) СЕМ слика инсулинских наночестица сушених распршивањем са манитолом; (е) слика лиофилизованих прашка инсулинских наночестица без манитола; (ф) слика лиофилизованих инсулинских наночестица са манитолом; (г) Слика инсулинских наночестица сушених распршивањем без манитола; (х) слика инсулинских наночестица сушених распршивањем са манитолом.
Током лиофилизације, манитол делује као криопротектант, одржавајући НЧ у аморфном облику и спречавајући оштећења кристалима леда19. Насупрот томе, нема корака замрзавања током сушења распршивањем. Стога манитол није потребан у овој методи. У ствари, НЧ сушене распршивањем без манитола дале су финије НЧ као што је претходно описано. Међутим, манитол и даље може деловати као пунило у процесу сушења распршивањем како би НЧ добиле сфернију структуру20 (Сл. 2д), што помаже у постизању равномерног понашања ослобађања таквих инкапсулираних НЧ. Поред тога, јасно је да се неке велике честице могу детектовати и у лиофилизованим и у сушеним распршивањем инсулинским НЧ које садрже манитол (Сл. 2б,д), што може бити последица акумулације манитола у језгру честице заједно са инкапсулираним инсулином. Слој хитозана. Вреди напоменути да је у овој студији, како би се осигурало да сферна структура остане нетакнута након дехидрације, однос манитола и хитозана одржаван на 5:1, тако да велика количина пунила такође може повећати величину честица осушених наночестица.
Фуријеова трансформациона инфрацрвена атенуирана тотална рефлексија (FTIR-ATR) спектроскопија окарактерисала је физичку смешу слободног инсулина, хитозана, хитозана, TPP и инсулина. Све дехидриране наночестице (НП) окарактерисане су коришћењем FTIR-ATR спектроскопије. Приметно је да су интензитети трака од 1641, 1543 и 1412 цм-1 примећени код енкапсулираних НП лиофилизованих са манитолом и код НП сушених распршивањем са и без манитола (Сл. 3). Као што је раније објављено, ова повећања чврстоће била су повезана са умрежавањем између хитозана, TPP и инсулина. Истраживање интеракције између хитозана и инсулина показало је да се у FTIR спектрима наночестица хитозана напуњених инсулином, трака хитозана преклапа са траком инсулина, повећавајући интензитет карбонилне (1641 цм-1) и аминске (1543 цм-1) траке. Триполифосфатне групе TPP су повезане са амонијум групама у хитозану, формирајући траку на 1412 цм-1.
FTIR-ATR спектри слободног инсулина, хитозана, физичких смеша хитозана/TPP/инсулина и NP дехидрираних различитим методама.
Штавише, ови резултати су у складу са резултатима приказаним у СЕМ-у, који је показао да су енкапсулиране НП остале нетакнуте и када су прскане и лиофилизоване са манитолом, али у одсуству манитола, само сушење распршивањем је произвело енкапсулиране честице. Насупрот томе, FTIR-ATR спектрални резултати НП лиофилизованих без манитола били су веома слични физичкој смеши хитозана, TPP и инсулина. Овај резултат указује да унакрсне везе између хитозана, TPP и инсулина више нису присутне у НП лиофилизованим без манитола. Структура НП је уништена током лиофилизације без криопротектанта, што се може видети у СЕМ резултатима (Слика 2а). На основу морфологије и FTIR резултата дехидрираних НП инсулина, само лиофилизоване, распршивано сушене и НП без манитола коришћене су за експерименте реконституције, а НП без манитола због разградње НП без манитола током дехидрације. дискутујте.
Дехидратација се користи за дугорочно складиштење и репроцесирање у друге формулације. Способност сувих НП да се реконституишу након складиштења је кључна за њихову употребу у различитим формулацијама као што су таблете и филмови. Приметили смо да се просечна величина честица инсулинских НП сушених распршивањем у одсуству манитола повећала само незнатно након реконституције. С друге стране, величина честица инсулинских наночестица сушених распршивањем и лиофилизованих са манитолом значајно се повећала (Табела 1). PDI и EE нису значајно промењени (p > 0,05) након рекомбинације свих НП у овој студији (Табела 1). Овај резултат указује да је већина честица остала нетакнута након поновног растварања. Међутим, додавање манитола је резултирало значајним смањењем инсулинског оптерећења лиофилизованих и сушених распршивањем наночестица манитола (Табела 1). Насупрот томе, садржај инсулинског оптерећења НП сушених распршивањем без манитола остао је исти као и пре (Табела 1).
Добро је познато да је пуњење наночестица критично када се користи за испоруку лекова. За НП са ниским пуњењем, потребне су веома велике количине материјала да би се достигао терапеутски праг. Међутим, висока вискозност тако високих концентрација НП доводи до непријатности и потешкоћа код оралног примењивања и инјекционих формулација, респективно 22. Поред тога, инсулинске НП се такође могу користити за израду таблета и вискозних биофилмова 23, 24, што захтева употребу великих количина НП при ниским нивоима пуњења, што резултира великим таблетама и дебелим биофилмовима који нису погодни за оралну примену. Стога су дехидриране НП са високим оптерећењем инсулином веома пожељне. Наши резултати сугеришу да високо оптерећење инсулином у НП сушеним распршивањем без манитола може понудити многе атрактивне предности за ове алтернативне методе испоруке.
Све дехидриране наночестице су чуване у фрижидеру три месеца. Резултати SEM-а су показали да се морфологија свих дехидрираних наночестица није значајно променила током тромесечног складиштења (Сл. 4). Након реконституције у води, све наночестице су показале благо смањење ЕЕ и ослободиле су приближно малу количину (~5%) инсулина током тромесечног периода складиштења (Табела 2). Међутим, просечна величина честица свих наночестица се повећала. Величина честица наночестица сушених распршивањем без манитола повећала се на 525 nm, док се величина честица наночестица сушених распршивањем и лиофилизованих са манитолом повећала на 872 и 921 nm, респективно (Табела 2).
Морфологија различитих дехидрираних инсулинских наночестица чуваних три месеца: (а) СЕМ слика лиофилизованих инсулинских наночестица са манитолом; (б) СЕМ слика инсулинских наночестица сушених распршивањем без манитола; (ц) без манитола СЕМ слике инсулинских наночестица сушених распршивањем.
Штавише, талози су примећени у реконституисаним инсулинским наночестицама сушеним распршивањем манитолом и лиофилизованим (Сл. С2). Ово може бити узроковано великим честицама које се не суспендују правилно у води. Сви горе наведени резултати показују да техника сушења распршивањем може заштитити инсулинске наночестице од дехидрације и да се велике количине инсулинских наночестица могу добити без икаквих пунила или криопротектанта.
Задржавање инсулина је тестирано у медијуму са pH = 2,5 са пепсином, трипсином и α-химотрипсином како би се показала заштитна способност НП од ензимске дигестије након дехидрације. Задржавање инсулина дехидрираних НП је упоређено са задржавањем инсулина код свеже припремљених НП, а слободни инсулин је коришћен као негативна контрола. У овој студији, слободни инсулин је показао брзу елиминацију инсулина у року од 4 сата у сва три ензимска третмана (Сл. 5а–ц). Насупрот томе, тестирање елиминације инсулина НП лиофилизованих са манитолом и НП сушених распршивањем са или без манитола показало је значајно већу заштиту ових НП од ензимске дигестије, што је било слично заштити свеже припремљених НП инсулина (слика 1).5а-ц). Уз помоћ наночестица у пепсину, трипсину и α-химотрипсину, више од 50%, 60% и 75% инсулина могло је бити заштићено у року од 4 сата, респективно (Сл. 5а–ц). Ова способност заштите инсулина може повећати шансу за већу апсорпцију инсулина у крвоток25. Ови резултати сугеришу да распршивање... Сушење са или без манитола и лиофилизација са манитолом могу сачувати инсулин-заштитну способност наночестица након дехидрације.
Заштита и понашање ослобађања дехидрираних НП инсулина: (а) заштита инсулина у раствору пепсина; (б) заштита инсулина у раствору трипсина; (ц) заштита инсулина раствором α-химотрипсина; (д) Понашање ослобађања дехидрираних НП у раствору pH = 2,5; (е) понашање ослобађања дехидрираних НП у раствору pH = 6,6; (ф) понашање ослобађања дехидрираних НП у раствору pH = 7,0.
Свеже припремљене и реконституисане суве инсулинске наночестице инкубиране су у различитим пуферима (pH = 2,5, 6,6, 7,0) на 37 °C, симулирајући pH окружење желуца, дванаестопалачног црева и горњег танког црева, како би се испитао ефекат инсулина на инсулинску резистенцију. Понашање ослобађања у различитим срединама. Фрагмент гастроинтестиналног тракта. При pH = 2,5, инсулином напуњене НП и ресолубилизоване суве инсулинске НП показале су почетно нагло ослобађање у првом сату, након чега је уследило споро ослобађање током наредних 5 сати (Сл. 5д). Ово брзо ослобађање на почетку је највероватније резултат брзе површинске десорпције протеинских молекула који нису потпуно имобилизовани у унутрашњој структури честице. При pH = 6,5, инсулином напуњене НП и реконституисане суве инсулинске НП показале су глатко и споро ослобађање током 6 сати, јер је pH тест раствора био сличан раствору припремљеном са НП (Сл. 5е). При pH = 7, НП су биле нестабилне и скоро потпуно разложене у прва два сата (Сл. 5ф). То је зато што се депротонација хитозана одвија при вишем pH, што резултира мање компактном полимерном мрежом и ослобађањем напуњеног инсулина.
Штавише, инсулинске НП сушене распршивањем без манитола показале су бржи профил ослобађања од осталих дехидрираних НП (Сл. 5д–ф). Као што је претходно описано, реконституисане инсулинске НП сушене без манитола показале су најмању величину честица. Мале честице пружају већу површину, тако да ће већина релевантног лека бити на или близу површине честице, што резултира брзим ослобађањем лека26.
Цитотоксичност НП је испитивана МТТ тестом. Као што је приказано на слици С4, утврђено је да све дехидриране НП немају значајан утицај на виталност ћелија при концентрацијама од 50–500 μг/мл, што сугерише да се све дехидриране НП могу безбедно користити за достизање терапијског прозора.
Јетра је главни орган преко којег инсулин врши своје физиолошке функције. HepG2 ћелије су ћелијска линија људског хепатома која се обично користи као in vitro модел апсорпције хепатоцита. Овде су HepG2 ћелије коришћене за процену ћелијске апсорпције дехидрираних наночестица коришћењем метода лиофилизације и сушења распршивањем. Ћелијска апсорпција конфокалним ласерским скенирањем коришћењем проточне цитометрије и вида након неколико сати инкубације са слободним FITC инсулином у концентрацији од 25 μг/мл, свеже припремљеним FITC инсулином напуњеним наночестицама и дехидрираним FITC инсулином напуњеним наночестицама при једнаким концентрацијама инсулина. Извршена су посматрања квантитативном микроскопијом (CLSM). Лиофилизоване наночестице без манитола су уништене током дехидрације и нису процењене у овом тесту. Интензитет интрацелуларне флуоресценције свеже припремљених наночестица напуњених инсулином, лиофилизованих наночестица са манитолом и распршено сушених наночестица са и без манитола (Слика 6а) био је 4,3, 2,6, 2,4 и 4,1 пута већи од слободних. FITC-инсулин група, респективно. (Сл. 6б). Ови резултати указују на то да је инкапсулирани инсулин снажнији у ћелијској апсорпцији од слободног инсулина, углавном због мање величине наночестица напуњених инсулином произведених у студији.
Апсорпција ћелија HepG2 након 4 сата инкубације са свеже припремљеним наночестицама и дехидрираним наночестицама: (а) Дистрибуција апсорпције FITC-инсулина од стране ћелија HepG2. (б) Геометријска средина интензитета флуоресценције анализирана проточном цитометријом (n = 3), *P < 0,05 у поређењу са слободним инсулином.
Исто тако, CLSM слике су показале да су интензитети FITC флуоресценције свеже припремљених FITC-инсулином наночестица и FITC-инсулином наночестица сушених распршивањем (без манитола) били много јачи од оних код осталих узорака (Сл. 6а). Штавише, уз додатак манитола, већи вискозитет раствора повећао је отпорност на ћелијско усвајање, што је резултирало смањеном пролиферацијом инсулина. Ови резултати сугеришу да су NP без манитола сушене распршивањем показале највећу ефикасност ћелијског усвајања јер је њихова величина честица била мања од величине лиофилизованих NP након поновног растварања.
Хитозан (просечна молекулска тежина 100 KDa, 75–85% деацетилиран) је купљен од компаније Sigma-Aldrich (Оквил, Онтарио, Канада). Натријум-триполифосфат (TPP) је купљен од компаније VWR (Раднор, Пенсилванија, САД). Рекомбинантни хумани инсулин коришћен у овој студији је од компаније Fisher Scientific (Волтам, Масачусетс, САД). Хумани инсулин обележен флуоресцеин изотиоцијанатом (FITC) и 4',6-диамидино-2-фенилиндол дихидрохлорид (DAPI) су купљени од компаније Sigma-Aldrich (Оквил, Онтарио, Канада). Ћелијска линија HepG2 је добијена од компаније ATCC (Манасас, Вирџинија, САД). Сви остали реагенси су били аналитичког или хроматографског квалитета.
Припремити раствор CS концентрације 1 мг/мл растварањем у двоструко дестилованој води (DD вода) која садржи 0,1% сирћетне киселине. Припремити растворе TPP и инсулина концентрације 1 мг/мл растварањем у DD води и 0,1% сирћетној киселини, респективно. Преемулзија је припремљена помоћу хомогенизатора велике брзине Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, САД). Процес припреме је следећи: прво, 2 мл раствора TPP се дода у 4 мл раствора инсулина, а смеша се меша 30 минута и добро измеша. Затим, помешани раствор је кап по кап додат у раствор CS помоћу шприца уз мешање великом брзином (10.000 о/мин). Смеше су држане уз мешање великом брзином (15.000 о/мин) у леденом купатилу током 30 минута, а затим су подешене на одређени pH да би се добиле умрежене инсулинске NP. Да би се даље хомогенизовале и смањила величина честица инсулинских NP, оне су сонициране додатних 30 минута у... ледено купатило помоћу соникатора типа сонде (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Телтов, Немачка).
НПС инсулина су тестирани на Z-просечни пречник, индекс полидисперзије (PDI) и зета потенцијал коришћењем мерења динамичког расејања светлости (DLS) помоћу Litesizer 500 (Anton Paar, Грац, Аустрија) разблаживањем у DD води на 25°C. Морфологија и расподела величине окарактерисане су трансмисионим електронским микроскопом (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Токио, Јапан), а слике су потом анализиране коришћењем Hitachi софтвера за снимање (Hitachi, Токио, Јапан). Да би се проценила ефикасност енкапсулације (EE) и капацитет пуњења (LC) НПС инсулина, НПС су пипетиране у ултрафилтрационе епрувете са граничном молекулском тежином од 100 kDa и центрифугиране на 500 xg током 30 минута. Некапсулирани инсулин у филтрату је квантификован коришћењем Agilent 1100 Series HPLC система (Agilent, Санта Клара, Калифорнија, САД) који се састоји од кватернарне пумпе, аутоматског узорковача, грејача колоне и DAD детектора. Инсулин је анализиран. помоћу колоне C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, САД) и детектоване на 214 nm. Мобилна фаза је била ацетонитрил и вода, са садржајем 0,1% TFA, односи градијента од 10/90 до 100/0, и трајала је 10 минута. Мобилна фаза је пумпана брзином протока од 1,0 ml/min. Температура колоне је подешена на 20 °C. Израчунајте проценте EE и LC користећи једначине (1) и једначину (2).
Различити односи CS/инсулин, у распону од 2,0 до 4,0, тестирани су како би се оптимизовале наночестице инсулина. Различите количине раствора CS су додате током припреме, док је смеша инсулина/TPP одржавана константном. Наночестице инсулина су припремљене у pH опсегу од 4,0 до 6,5 пажљивим контролисањем pH смеше након додавања свих раствора (инсулин, TPP и CS). ЕЕ и величина честица наночестица инсулина су процењене при различитим pH вредностима и масеним односима CS/инсулин како би се оптимизовало формирање наночестица инсулина.
Оптимизоване инсулинске наночестице су постављене на алуминијумску посуду и прекривене тканином затегнутом траком. Након тога, посуде са завртњима су стављене у Labconco FreeZone лиофилизатор (Labconco, Канзас Сити, Мисури, САД) опремљен сушачем са послужавником. Температура и вакуумски притисак су подешени на -10 °C, 0,350 Torr током прва 2 сата, и 0 °C и 0,120 Torr током преосталих 22 сата од 24 сата да би се добиле суве инсулинске наночестице.
За генерисање инкапсулираног инсулина коришћен је Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Флавил, Швајцарска). Одабрани параметри сушења били су: температура 100 °C, проток 3 L/min и проток гаса 4 L/min.
Наночестице инсулина пре и после дехидрације окарактерисане су коришћењем FTIR-ATR спектроскопије. Дехидриране наночестице, као и слободни инсулин и хитозан, анализирани су коришћењем Spectrum 100 FTIR спектрофотометра (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, САД) опремљеног универзалним ATR додатком за узорковање (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, САД). Просеци сигнала добијени су из 16 скенирања при резолуцији од 4 cm² у фреквентном опсегу од 4000-600 cm².
Морфологија сувих инсулинских наночестица процењена је SEM сликама лиофилизованих и распршивачки сушених инсулинских наночестица снимљених Helios NanoLab 650 фокусираним јонским снопом за скенирање електронским микроскопом (FIB-SEM) (FEI, Хилсборо, Орегон, САД). Главни коришћени параметар био је напон 5 keV и струја 30 mA.
Све дехидриране инсулинске наночестице су поново растворене у дехидрираној води. Величина честица, PDI, EE и LC су поново тестирани коришћењем исте методе која је раније поменута како би се проценио њихов квалитет након дехидрације. Стабилност анхидроинсулинских наночестица је такође мерена тестирањем својстава наночестица након дужег складиштења. У овој студији, све наночестице након дехидрације су складиштене у фрижидеру три месеца. Након три месеца складиштења, наночестице су тестиране на морфолошку величину честица, PDI, EE и LC.
Растворити 5 mL реконституисаних NP у 45 mL симулираног желудачног сока (pH 1,2, који садржи 1% пепсина), цревног сока (pH 6,8, који садржи 1% трипсина) или раствора химотрипсина (100 g/mL, у фосфатном пуферу, pH 7,8) да би се проценила ефикасност инсулина у заштити NP након дехидрације. Инкубиране су на 37°C са брзином мешања од 100 о/мин. 500 μL раствора је сакупљено у различитим временским тачкама, а концентрација инсулина је одређена HPLC-ом.
Понашање ослобађања ин витро свеже припремљених и дехидрираних инсулинских наночестица тестирано је методом дијализне кесе (гранична молекулска тежина 100 kDa, Spectra Por Inc.). Свеже припремљене и реконституисане суве наночестице су дијализоване у течностима на pH 2,5, pH 6,6 и pH 7,0 (0,1 M фосфатно пуферовани физиолошки раствор, PBS) да би се симулирала pH средина желуца, дванаестопалачног црева и горњег дела танког црева, респективно. Сви узорци су инкубирани на 37 °C уз континуирано мућкање на 200 о/мин. Аспирирајте течност изван дијализне кесе од 5 mL у следећим временима: 0,5, 1, 2, 3, 4 и 6 h, и одмах допуните запремину свежим дијализатом. Контаминација инсулином у течности је анализирана HPLC-ом, а брзина ослобађања инсулина из наночестица је израчуната из односа ослобођеног слободног инсулина и укупног инсулина инкапсулираног у наночестицама (Једначина 3).
Ћелије ћелијске линије хуманог хепатоцелуларног карцинома HepG2 узгајане су у посудама пречника 60 mm користећи Дулбеков модификовани Иглов медијум (DMEM) који садржи 10% феталног говеђег серума, 100 IU/mL пеницилина и 100 μg/mL стрептомицина29. Културе су одржаване на 37°C, 95% релативне влажности и 5% CO2. За тестове апсорпције, HepG2 ћелије су посејане у количини од 1 × 10⁶ ћелија/ml на систем са 8 бунарића Nunc Lab-Tek комором (Thermo Fisher, NY, САД). За тестове цитотоксичности, посејане су у плоче са 96 бунарића (Corning, NY, САД) у густини од 5 × 10⁶ ћелија/ml.
МТТ тест је коришћен за процену цитотоксичности свеже припремљених и дехидрираних инсулинских НП30. Ћелије HepG2 су посејане у плоче са 96 бунарића при густини од 5 × 10⁴ ћелија/мл и култивисане 7 дана пре тестирања. Инсулинске НП су разблажене до различитих концентрација (50 до 500 μг/мл) у медијуму за култивацију, а затим примењене на ћелије. Након 24 сата инкубације, ћелије су испране 3 пута са PBS и инкубиране са медијумом који садржи 0,5 мг/мл МТТ током додатних 4 сата. Цитотоксичност је процењена мерењем ензимске редукције жутог тетразолијум МТТ у љубичасти формазан на 570 nm коришћењем Tecan infinite M200 pro спектрофотометра за читање плоча (Tecan, Männedorf, Швајцарска).
Ефикасност ћелијског апсорпције НП тестирана је конфокалном ласерском скенирајућом микроскопијом и анализом проточне цитометрије. Сваки бунарчић система комора Nunc Lab-Tek третиран је слободним FITC-инсулином, НП напуњеним FITC-инсулином и реконституисаним 25 μг/мл дехидрираних FITC-инсулински НП у истој концентрацији и инкубиран 4 сата. Ћелије су испране 3 пута са PBS и фиксиране са 4% параформалдехидом. Језгра су обојена 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Локализација инсулина је посматрана коришћењем Olympus FV1000 ласерског скенирајућег/двофотонског конфокалног микроскопа (Olympus, Шинџуку Сити, Токио, Јапан). За анализу проточне цитометрије, исте концентрације од 10 μг/мл слободног FITC-инсулина, НП напуњених FITC-инсулином и ресолубилизованих дехидрираних FITC-инсулински НП додате су на 96-бунарчићне плоче засејане HepG2 ћелијама и инкубиране 4 сата. Након 4 сата инкубације, ћелије су уклоњене и испране 3 пута са FBS. 5 × 10⁴ ћелија по узорку је анализирано помоћу BD LSR II проточног цитометра (BD, Франклин Лејкс, Њу Џерзи, Сједињене Америчке Државе).
Све вредности су изражене као средња вредност ± стандардна девијација. Поређења између свих група су процењена коришћењем једнофакторске ANOVA или t-теста помоћу IBM SPSS Statistics 26 за Mac (IBM, Endicott, Њујорк, САД) и p < 0,05 је сматрано статистички значајним.
Ова студија показује флексибилност и способност сушења распршивањем да дехидрира умрежене наночестице хитозана/ТПП/инсулина са бољом реконституцијом у поређењу са стандардним методама лиофилизације коришћењем средстава за повећање запремине или криопротектанта и већим капацитетом оптерећења. Оптимизоване наночестице инсулина дале су просечну величину честица од 318 nm и ефикасност енкапсулације од 99,4%. Резултати SEM и FTIR након дехидрације показали су да је сферна структура одржавана само у наночестицама сушеним распршивањем са и без манитола и лиофилизованим са манитолом, али су лиофилизоване наночестице без манитола разложене током дехидрације. У тесту способности реконституције, наночестице инсулина сушене распршивањем без манитола показале су најмању средњу величину честица и највеће оптерећење након реконституције. Понашање ослобађања свих ових дехидрираних наночестица показало је да се брзо ослобађају у растворима pH = 2,5 и pH = 7, и веома стабилне у раствору pH = 6,5. У поређењу са другим поново раствореним дехидрираним наночестицама, наночестице сушене распршивањем без манитола показале су најбрже... ослобађање. Овај резултат је у складу са оним примећеним у тесту ћелијске апсорпције, јер су наночестице сушене распршивањем у одсуству манитола скоро у потпуности задржале ефикасност ћелијске апсорпције свеже припремљених наночестица. Ови резултати сугеришу да су суве инсулинске наночестице припремљене сушењем распршивањем без манитола најпогодније за даљу прераду у друге безводне дозне облике, као што су оралне таблете или биоадхезивни филмови.
Због питања интелектуалне својине, скупови података генерисани и/или анализирани током текуће студије нису јавно доступни, али су доступни од одговарајућих аутора на разуман захтев.
Каган, А. Дијабетес типа 2: друштвено и научно порекло, медицинске компликације и импликације за пацијенте и друге. (McFarlane, 2009).
Синг, АП, Гуо, Ј., Синг, А., Сје, В. и Ђијанг, П. Развој енкапсулације инсулина: да ли је орална примена сада могућа? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Вонг, Ц.Ј., Ал-Салами, Х. и Дас, Ц.Р. Недавни напредак у системима за испоруку оралних липозома напуњених инсулином за лечење дијабетеса. Интерпретација. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).