Чланак је део истраживачке теме „Побољшање отпорности махунарки на патогене и штеточине“, погледајте свих 5 чланака
Узрочник гљивичне болести биљака, некрозе, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, користи вишеслојну стратегију за инфицирање различитих биљака домаћина. Ова студија предлаже употребу диамина L-орнитина, непротеинске аминокиселине која стимулише синтезу других есенцијалних аминокиселина, као алтернативну стратегију управљања за побољшање молекуларних, физиолошких и биохемијских одговора Phaseolus vulgaris L. на белу плесан коју изазива Pseudomonas sclerotiorum. Експерименти in vitro су показали да L-орнитин значајно инхибира раст мицелија S. pyrenoidosa на начин зависан од дозе. Штавише, могао би значајно смањити озбиљност беле плесни у условима стаклене баште. Поред тога, L-орнитин је стимулисао раст третираних биљака, што указује да тестиране концентрације L-орнитина нису биле фитотоксичне за третиране биљке. Поред тога, Л-орнитин је побољшао експресију неензимских антиоксиданата (укупни растворљиви феноли и флавоноиди) и ензимских антиоксиданата (каталаза (CAT), пероксидаза (POX) и полифенол оксидаза (PPO)), и повећао експресију три гена повезана са антиоксидантима (PvCAT1, PvSOD и PvGR). Штавише, in silico анализа је открила присуство претпостављеног протеина оксалоацетат ацетилхидролазе (SsOAH) у геному S. sclerotiorum, који је био веома сличан протеинима оксалоацетат ацетилхидролазе (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) и Penicillium sp. (PlOAH) у смислу функционалне анализе, конзервисаних домена и топологије. Занимљиво је да је додавање Л-орнитина у медијум од кромпирове декстрозе (PDB) значајно смањило експресију гена SsOAH у мицелију S. sclerotiorum. Слично томе, егзогена примена Л-орнитина значајно је смањила експресију SsOAH гена у гљивичном мицелијуму сакупљеном из третираних биљака. Коначно, примена Л-орнитина значајно је смањила лучење оксалне киселине и у PDB медијуму и у зараженим листовима. Закључно, Л-орнитин игра кључну улогу у одржавању редокс статуса, као и у побољшању одбрамбеног одговора заражених биљака. Резултати ове студије могу помоћи у развоју иновативних, еколошки прихватљивих метода за контролу беле плесни и ублажавање њеног утицаја на производњу пасуља и других усева.
Бела плесан, коју изазива некротрофна гљивица Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, је разорна болест која смањује принос и представља озбиљну претњу глобалној производњи пасуља (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum је један од најтежих за сузбијање гљивичних биљних патогена који се преносе земљиштем, са широким спектром домаћина од преко 600 биљних врста и способношћу брзе мацерације ткива домаћина на неспецифичан начин (Liang and Rollins, 2018). Под неповољним условима, пролази кроз критичну фазу свог животног циклуса, остајући у стању мировања током дужег временског периода као црне, тврде, семену сличне структуре зване „склероције“ у земљишту или као беле, пахуљасте израслине у мицелијуму или сржи стабљике заражених биљака (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum је способна да формира склероције, што јој омогућава да преживи у зараженим пољима током дужег временског периода и да опстане током болести (Schwartz et al., 2005). Склероције су богате хранљивим материјама, могу да опстану у земљишту током дужег временског периода и служе као примарни инокулум за накнадне инфекције (Schwartz et al., 2005). Под повољним условима, склероције клијају и производе споре које се преносе ваздухом и које могу да заразе све надземне делове биљке, укључујући, али не ограничавајући се на, цветове, стабљике или махуне (Schwartz et al., 2005).
Склеротинија склеротиорум користи вишеслојну стратегију за инфицирање биљака домаћина, која укључује низ координисаних догађаја, од клијања склероција до развоја симптома. У почетку, С. склеротиорум производи суспендоване споре (назване аскоспоре) из структура сличних печуркама названих апотеције, које се преносе ваздухом и развијају у непокретне склероције на зараженим биљним остацима (Болтон и др., 2006). Гљивица затим лучи оксалну киселину, фактор вируленције, како би контролисала pH вредност ћелијског зида биљке, подстакла ензимску разградњу и инвазију ткива (Хегедус и Риммер, 2005) и сузбила оксидативни налет биљке домаћина. Овај процес закисељавања слаби ћелијски зид биљке, пружајући повољно окружење за нормалан и ефикасан рад ензима који разграђују ћелијски зид гљивица (CWDEs), омогућавајући патогену да превазиђе физичку баријеру и продре у ткива домаћина (Марцијано и др., 1983). Једном када продре, S. sclerotiorum лучи бројне CWDE, као што су полигалактуроназа и целулаза, што олакшава његову ширење у зараженим ткивима и изазива некрозу ткива. Прогресија лезија и хифалних подлога доводи до карактеристичних симптома беле плесни (Hegedus and Rimmer, 2005). У међувремену, биљке домаћини препознају молекуларне обрасце повезане са патогенима (PAMP) путем рецептора за препознавање образаца (PRR), покрећући низ сигналних догађаја који на крају активирају одбрамбене одговоре.
Упркос деценијама напора у контроли болести, недостатак адекватне отпорне герминативне плазме и даље постоји код пасуља, као и код других комерцијалних усева, због отпорности, преживљавања и прилагодљивости патогена. Сузбијање болести је стога изузетно изазовно и захтева интегрисану, вишеслојну стратегију која укључује комбинацију агротехничких пракси, биолошке контроле и хемијских фунгицида (O'Sullivan et al., 2021). Хемијска контрола беле плесни је најефикаснија јер фунгициди, када се примене правилно и у право време, могу ефикасно контролисати ширење болести, смањити тежину инфекције и минимизирати губитке приноса. Међутим, прекомерна употреба и прекомерно ослањање на фунгициде може довести до појаве резистентних сојева S. sclerotiorum и негативно утицати на организме који нису циљани, здравље земљишта и квалитет воде (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Стога је проналажење еколошки прихватљивих алтернатива постало главни приоритет.
Полиамини (ПА), као што су путресцин, спермидин, спермин и кадаверин, могу послужити као обећавајуће алтернативе против биљних патогена који се преносе земљиштем, чиме се потпуно или делимично смањују употреба опасних хемијских фунгицида (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Код виших биљака, ПА су укључени у многе физиолошке процесе, укључујући, али не ограничавајући се на, деобу ћелија, диференцијацију и одговор на абиотске и биотске стресове (Killiny and Nehela, 2020). Они могу деловати као антиоксиданти, помоћи у уклањању реактивних врста кисеоника (ROS), одржавати редокс хомеостазу (Nehela and Killiny, 2023), индуковати гене повезане са одбраном (Romero et al., 2018), регулисати различите метаболичке путеве (Nehela and Killiny, 2023), модулирати ендогене фитохормоне (Nehela and Killiny, 2019), успоставити системску стечену отпорност (SAR) и регулисати интеракције биљака и патогена (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Вреди напоменути да се специфични механизми и улоге ПА у одбрани биљака разликују у зависности од биљне врсте, патогена и услова околине. Најзаступљенија ПА у биљкама се биосинтетише из есенцијалног полиамина L-орнитина (Killiny and Nehela, 2020).
Л-орнитин игра вишеструке улоге у расту и развоју биљака. На пример, претходне студије су показале да код пиринча (Oryza sativa), орнитин може бити повезан са рециклажом азота (Liu et al., 2018), приносом, квалитетом и аромом пиринча (Lu et al., 2020) и одговором на стрес од воде (Yang et al., 2000). Штавише, егзогена примена Л-орнитина значајно је побољшала толеранцију на сушу код шећерне репе (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) и ублажила стрес од соли код биљака црног лука (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) и индијског ораха (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Потенцијална улога Л-орнитина у одбрани од абиотског стреса може бити последица његовог учешћа у акумулацији пролина у третираним биљкама. На пример, раније је објављено да су гени повезани са метаболизмом пролина, као што су гени орнитин делта аминотрансферазе (делта-OAT) и пролин дехидрогеназе (ProDH1 и ProDH2), укључени у одбрану Nicotiana benthamiana и Arabidopsis thaliana од сојева Pseudomonas syringae који нису домаћини (Senthil-Kumar и Mysore, 2012). С друге стране, гљивична орнитин декарбоксилаза (ODC) је неопходна за раст патогена (Singh et al., 2020). Циљање ODC-а Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici путем утишавања гена индукованог домаћином (HIGS) значајно је побољшало отпорност биљака парадајза на Fusarium венуће (Singh et al., 2020). Међутим, потенцијална улога егзогене примене орнитина против биотских стресова као што су фитопатогени није добро проучена. Још важније, ефекти орнитина на отпорност на болести и повезане биохемијске и физиолошке појаве остају углавном неистражени.
Разумевање сложености инфекције махунарки изазване S. sclerotiorum је важно за развој ефикасних стратегија сузбијања. У овој студији, циљ нам је био да идентификујемо потенцијалну улогу диамина L-орнитина као кључног фактора у побољшању одбрамбених механизама и отпорности биљака махунарки на инфекцију Sclerotinia sclerotiorum. Претпостављамо да, поред побољшања одбрамбених одговора заражених биљака, L-орнитин такође игра кључну улогу у одржавању редокс статуса. Претпостављамо да су потенцијални ефекти L-орнитина повезани са регулацијом ензимских и неензимских антиоксидативних одбрамбених механизама и интерференцијом са факторима гљивичне патогености/вируленције и повезаним протеинима. Ова двострука функционалност L-орнитина чини га обећавајућим кандидатом за одрживу стратегију ублажавања утицаја беле плесни и побољшања отпорности уобичајених усева махунарки на овај снажан гљивични патоген. Резултати ове студије могу помоћи у развоју иновативних, еколошки прихватљивих метода за сузбијање беле плесни и ублажавање њеног утицаја на производњу махунарки.
У овој студији, осетљива комерцијална сорта обичног пасуља, Гиза 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), коришћена је као експериментални материјал. Здраво семе је љубазно обезбедило Одељење за истраживање махунарки, Институт за истраживање пољских усева (FCRI), Пољопривредни истраживачки центар (ARC), Египат. Пет семена је посејано у пластичне саксије (унутрашњи пречник 35 цм, дубина 50 цм) напуњене земљиштем зараженим S. sclerotiorum у условима стаклене баште (25 ± 2 °C, релативна влажност 75 ± 1%, 8 сати светлости/16 сати мрака). 7–10 дана након сетве (DPS), саднице су проређене тако да су у свакој саксији остале само две саднице са уједначеним растом и три потпуно развијена листа. Све биљке у саксијама су заливане једном у две недеље и ђубрене месечно препорученом брзином за дату сорту.
Да би се припремила концентрација L-орнитиндиамина (такође познатог као (+)-(S)-2,5-диаминопентаноинска киселина; Sigma-Aldrich, Дармштат, Немачка) од 500 мг/Л, 50 мг је прво растворено у 100 мл стерилне дестиловане воде. Основни раствор је затим разблажен и коришћен у наредним експериментима. Укратко, шест серија концентрација L-орнитина (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 мг/Л) је тестирано in vitro. Поред тога, стерилна дестилована вода је коришћена као негативна контрола (Mock), а комерцијални фунгицид „Rizolex-T“ 50% квасиви прах (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, губернија Гарбија, Египат) је коришћен као позитивна контрола. Комерцијални фунгицид „Rizolex-T“ је тестиран in vitro у пет концентрација (2, 4, 6, 8 и 10 mg/L).
Узорци стабљика и махуна обичног пасуља који показују типичне симптоме беле плесни (стопа заразе: 10–30%) прикупљени су са комерцијалних фарми. Иако је већина зараженог биљног материјала идентификована по врсти/сорти (осетљива комерцијална сорта Гиза 3), други, посебно они добијени са локалних пијаца, били су непознате врсте. Прикупљени заражени материјали су прво површински дезинфиковани 0,5% раствором натријум хипохлорита током 3 минута, затим неколико пута испрани стерилном дестилованом водом и обрисани сувим стерилним филтер папиром како би се уклонио вишак воде. Заражени органи су затим исечени на мале комаде из средњег ткива (између здравог и зараженог ткива), култивисани на подлози од кромпир декстрозног агара (ПДА) и инкубирани на 25 ± 2 °C са циклусом од 12 сати светлости/12 сати таме током 5 дана како би се стимулисало формирање склероција. Метода мицелијумског врха је такође коришћена за пречишћавање гљивичних изолата из мешовитих или контаминираних култура. Пречишћени гљивични изолат је прво идентификован на основу својих културних морфолошких карактеристика, а затим је потврђено да је S. sclerotiorum на основу микроскопских карактеристика. Коначно, сви пречишћени изолати су тестирани на патогеност на осетљивом култивару пасуља Гиза 3 како би се испунили Кохови постулати.
Поред тога, најинвазивнији изолат S. sclerotiorum (изолат бр. 3) је додатно потврђен на основу секвенцирања интерног транскрибованог размакног ћелија (ITS) као што је описано од стране White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Укратко, изолати су култивисани у бујону од декстрозе кромпира (PDB) и инкубирани на 25 ± 2 °C током 5–7 дана. Гљивични мицелијум је затим сакупљен, филтриран кроз газу, испран два пута стерилном водом и осушен стерилним филтер папиром. Геномска ДНК је изолована коришћењем Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Регион ITS рДНК је затим амплификован коришћењем специфичног пара прајмера ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; очекивана величина: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Пречишћени PCR производи су послати на секвенцирање (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Секвенце ITS рДНК су секвенциране двосмерно коришћењем Сангерове методе секвенцирања. Састављене секвенце упита су затим упоређене са најновијим подацима у GenBank и Националном центру за биотехнолошке информације (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) коришћењем BLASTn софтвера. Секвенца упита је упоређена са 20 других сојева/изолата S. sclerotiorum добијених из најновијих података у NCBI GenBank (Допунска табела S1) коришћењем ClustalW у пакету за молекуларну еволуциону генетику (MEGA-11; верзија 11) (Kumar et al., 2024). Еволуциона анализа је извршена коришћењем методе максималне вероватноће и општег временски реверзибилног модела супституције нуклеотида (Nei и Kumar, 2000). Приказано је стабло са највећом логаритамском вероватноћом. Почетно стабло за хеуристичку претрагу је одабрано избором стабла са већом логаритамском вероватноћом између стабла спајања суседа (NJ) (Kumar et al., 2024) и стабла максималне штедње (MP). NJ стабло је конструисано коришћењем матрице парних растојања израчунате коришћењем општег временски реверзибилног модела (Nei и Kumar, 2000).
Антибактеријска активност Л-орнитина и бактерицида „Ризолекс-Т“ одређена је in vitro методом дифузије у агар. Метод: Узети одговарајућу количину основног раствора Л-орнитина (500 мг/Л) и добро је помешати са 10 мл ПДА хранљиве подлоге да би се припремили раствори са коначним концентрацијама од 12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 мг/Л, респективно. Пет концентрација фунгицида „Ризолекс-Т“ (2, 4, 6, 8 и 10 мг/Л) и стерилна дестилована вода коришћени су као контрола. Након што се подлога стврднула, свеже припремљени мицелијумски чеп културе Sclerotinia sclerotiorum, пречника 4 мм, пренет је у центар Петријеве шоље и култивисан на 25±2°C док мицелијум није прекрио целу контролну Петријеву шољу, након чега је забележен раст гљивица. Израчунајте проценат инхибиције радијалног раста S. sclerotiorum користећи једначину 1:
Експеримент је поновљен два пута, са шест биолошких понављања за сваку контролну/експерименталну групу и пет саксија (две биљке по саксији) за свако биолошко понављање. Свако биолошко понављање је анализирано два пута (два техничка понављања) како би се осигурала тачност, поузданост и репродуктивност експерименталних резултата. Поред тога, коришћена је пробит регресиона анализа за израчунавање полумаксималне инхибиторне концентрације (IC50) и IC99 (Prentice, 1976).
Да би се проценио потенцијал Л-орнитина у условима стаклене баште, спроведена су два узастопна експеримента у саксијама. Укратко, саксије су напуњене стерилисаном глиновито-песковитом земљом (3:1) и инокулиране свеже припремљеном културом S. sclerotiorum. Прво, најинвазивнији изолат S. sclerotiorum (изолат #3) је култивисан пресецањем једног склероцијума на пола, постављањем лицем надоле на ПДА и инкубирањем на 25°C у сталном мраку (24 сата) током 4 дана како би се стимулисао раст мицелија. Затим су четири агар чепа пречника 5 мм узета са предње ивице и инокулирана са 100 г стерилне мешавине пшеничних и пиринчаних мекиња (1:1, v/v) и све бочице су инкубиране на 25 ± 2°C у циклусу од 12 сати светлости/12 сати мрака током 5 дана како би се стимулисало формирање склероција. Садржај свих бочица је темељно помешан како би се осигурала хомогеност пре додавања земље. Затим је у сваку саксију додато 100 г мешавине мекиња за колонизацију како би се осигурала константна концентрација патогена. Инокулиране саксије су заливене да би се активирао раст гљивица и стављене у услове стакленика на 7 дана.
У сваку саксију је затим посејано пет семена сорте Гиза 3. За саксије третиране Л-орнитином и фунгицидом Ризолекс-Т, стерилизовано семе је прво натопљено два сата у воденом раствору два једињења са коначном концентрацијом IC99 од око 250 мг/Л и 50 мг/Л, респективно, а затим је сушено на ваздуху један сат пре сетве. С друге стране, семе је натопљено у стерилној дестилованој води као негативна контрола. После 10 дана, пре првог заливања, саднице су проређене, остављајући само две уредне саднице у свакој саксији. Поред тога, да би се осигурала инфекција са S. sclerotiorum, стабљике биљака пасуља у истој фази развоја (10 дана) су исечене на два различита места помоћу стерилисаног скалпела и приближно 0,5 г колонизујуће смеше мекиња је стављено у сваку рану, након чега је уследила висока влажност ваздуха како би се стимулисала инфекција и развој болести код свих инокулираних биљака. Контролне биљке су слично повређене и једнака количина (0,5 г) стерилне, неколонизоване мешавине мекиња је стављена у рану и одржавана под високом влажношћу како би се симулирало окружење за развој болести и осигурала доследност између група третмана.
Метода третмана: Саднице пасуља су заливене са 500 мл воденог раствора Л-орнитина (250 мг/л) или фунгицида Ризолекс-Т (50 мг/л) наводњавањем земљишта, затим је третман поновљен три пута у размаку од 10 дана. Контролне групе третиране плацебом су заливене са 500 мл стерилне дестиловане воде. Сви третмани су спроведени у условима стаклене баште (25 ± 2°C, 75 ± 1% релативне влажности и фотопериод од 8 сати светлости/16 сати мрака). Све саксије су заливене сваке две недеље и третиране месечно уравнотеженим NPK ђубривом (20-20-20, са 3,6% сумпора и ТЕ микроелементима; Zain Seeds, Египат) у концентрацији од 3–4 г/л фолијарним прскањем према препорукама за одређену сорту и упутствима произвођача. Осим ако није другачије назначено, потпуно развијени зрели листови (2. и 3. лист одозго) су сакупљени из сваке биолошке реплике 72 сата након третмана (хпт), хомогенизовани, обједињени и чувани на -80 °C за даље анализе, укључујући, али не ограничавајући се на, in situ хистохемијску локализацију индикатора оксидативног стреса, липидну пероксидацију, ензимске и неензимске антиоксиданте и експресију гена.
Интензитет инфекције белом плесни процењиван је недељно 21 дан након инокулације (dpi) користећи скалу од 1–9 (Додатна табела S2) засновану на скали Пецолдта и Диксона (1996) коју су модификовали Теран и др. (2006). Укратко, стабљике и гране биљака пасуља су прегледане почевши од места инокулације како би се пратило напредовање лезија дуж интернодија и чворова. Затим је мерена удаљеност лезије од места инокулације до најудаљеније тачке дуж стабљике или гране и додељен је резултат од 1–9 на основу локације лезије, где (1) указује на одсуство видљиве инфекције у близини места инокулације, а (2–9) указује на постепено повећање величине лезије и напредовање дуж чворова/интернодија (Додатна табела S2). Интензитет инфекције белом плесни је затим претворен у проценат користећи формулу 2:
Поред тога, површина испод криве прогресије болести (AUDPC) је израчуната коришћењем формуле (Shaner and Finney, 1977), која је недавно прилагођена за белу трулеж обичног пасуља (Chauhan et al., 2020) коришћењем једначине 3:
Где је Yi = тежина болести у времену ti, Yi+1 = тежина болести у следећем времену ti+1, ti = време првог мерења (у данима), ti+1 = време следећег мерења (у данима), n = укупан број временских тачака или тачака посматрања. Параметри раста биљке пасуља, укључујући висину биљке (цм), број грана по биљци и број листова по биљци, бележени су недељно током 21 дана у свим биолошким понављањима.
У свакој биолошкој реплици, узорци листова (други и трећи потпуно развијени лист од врха) су сакупљени 45. дана након третмана (15 дана након последњег третмана). Свака биолошка реплика се састојала од пет саксија (две биљке по саксији). Око 500 мг уситњеног ткива је коришћено за екстракцију фотосинтетских пигмената (хлорофил а, хлорофил б и каротеноиди) коришћењем 80% ацетона на 4 °C у мраку. Након 24 сата, узорци су центрифугирани, а супернатант је сакупљен за колориметријско одређивање садржаја хлорофила а, хлорофила б и каротеноида коришћењем UV-160A спектрофотометра (Shimadzu Corporation, Јапан) према методи (Lichtenthaler, 1987) мерењем апсорбанције на три различите таласне дужине (A470, A646 и A663 nm). Коначно, садржај фотосинтетских пигмената је израчунат коришћењем следећих формула 4–6 које је описао Lichtenthaler (1987).
72 сата након третмана (хпт), листови (други и трећи потпуно развијени лист од врха) су сакупљени из сваке биолошке реплике за in situ хистохемијску локализацију водоник-пероксида (H2O2) и супероксидног ањона (O2•−). Свака биолошка реплика се састојала од пет саксија (две биљке по саксији). Свака биолошка реплика је анализирана у дупликату (две техничке реплике) како би се осигурала тачност, поузданост и репродуктивност методе. H2O2 и O2•− су одређени коришћењем 0,1% 3,3′-диаминобензидина (DAB; Sigma-Aldrich, Дармштат, Немачка) или нитроплавог тетразолијума (NBT; Sigma-Aldrich, Дармштат, Немачка), респективно, пратећи методе које су описали Ромеро-Пуертас и др. (2004) и Адам и др. (1989) са мањим модификацијама. За хистохемијску локализацију H2O2 in situ, листићи су вакуумски инфилтрирани са 0,1% DAB у 10 mM Tris пуферу (pH 7,8), а затим инкубирани на собној температури на светлости током 60 минута. Листићи су избељени у 0,15% (v/v) TCA у 4:1 (v/v) етанол:хлороформу (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каиро, Египат), а затим изложени светлости док нису потамнели. Слично томе, вентили су вакуумски инфилтрирани са 10 mM калијум фосфатним пуфером (pH 7,8) који садржи 0,1 w/v % HBT за хистохемијску локализацију O2•− in situ. Листићи су инкубирани на светлости на собној температури током 20 минута, затим избељени као горе, а затим осветљени док се нису појавиле тамноплаве/љубичасте мрље. Интензитет резултујуће смеђе (као H2O2 индикатор) или плаво-љубичасте (као O2•− индикатор) боје процењен је коришћењем Fiji верзије пакета за обраду слика ImageJ (http://fiji.sc; приступљено 7. марта 2024).
Малондијалдехид (MDA; као маркер липидне пероксидације) је одређен према методи Ду и Брамлаџа (1992) са мањим модификацијама. Листови из сваке биолошке реплике (други и трећи потпуно развијени лист од врха) су сакупљени 72 сата након третмана (хпт). Свака биолошка реплика је укључивала пет саксија (две биљке по саксији). Свака биолошка реплика је анализирана у дупликату (две техничке реплике) како би се осигурала тачност, поузданост и репродуктивност методе. Укратко, 0,5 г млевеног ткива листа је коришћено за екстракцију MDA са 20% трихлорсирћетном киселином (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, САД) која садржи 0,01% бутилованог хидрокситолуена (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, САД). Садржај MDA у супернатанту је затим одређен колориметријски мерењем апсорбанције на 532 и 600 nm коришћењем UV-160A спектрофотометра (Shimadzu Corporation, Јапан) и затим изражен као nmol g−1 FW.
За процену неензимских и ензимских антиоксиданата, листови (други и трећи потпуно развијени лист од врха) су сакупљени из сваке биолошке реплике 72 сата након третмана (хпт). Свака биолошка реплика се састојала од пет саксија (две биљке по саксији). Сваки биолошки узорак је анализиран у дупликату (два техничка узорка). Два листа су млевена течним азотом и директно коришћена за одређивање ензимских и неензимских антиоксиданата, укупних аминокиселина, садржаја пролина, експресије гена и квантификације оксалата.
Укупни растворљиви феноли одређени су коришћењем Фолин-Чокалтеу реагенса (Sigma-Aldrich, Сент Луис, Мисури, САД) са мањим модификацијама методе коју су описали Кахконен и др. (1999). Укратко, приближно 0,1 г хомогенизованог ткива листа екстраховано је са 20 мл 80% метанола у мраку током 24 сата, а супернатант је сакупљен након центрифугирања. 0,1 мл екстракта узорка помешано је са 0,5 мл Фолин-Чокалтеу реагенса (10%), мућкано 30 секунди и остављено у мраку 5 минута. Затим је у сваку епрувету додато 0,5 мл 20% раствора натријум карбоната (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Каиро, Египат), добро промешано и инкубирано на собној температури у мраку током 1 сата. Након инкубације, апсорбанција реакционе смеше је мерена на 765 nm коришћењем UV-160A спектрофотометра (Shimadzu Corporation, Јапан). Концентрација укупних растворљивих фенола у екстрактима узорака одређена је коришћењем калибрационе криве галне киселине (Fisher Scientific, Hampton, NH, САД) и изражена је као милиграми еквивалента галне киселине по граму свеже тежине (mg GAE g-1 свеже тежине).
Укупан садржај растворљивих флавоноида одређен је према методи Џеридана и др. (2006) са мањим модификацијама. Укратко, 0,3 мл горе наведеног метанолног екстракта помешано је са 0,3 мл 5% раствора алуминијум хлорида (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, САД), снажно мешано, а затим инкубирано на собној температури 5 минута, након чега је додато 0,3 мл 10% раствора калијум ацетата (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каиро, Египат), темељно промешано и инкубирано на собној температури 30 минута у мраку. Након инкубације, апсорбанција реакционе смеше мерена је на 430 nm помоћу UV-160A спектрофотометра (Shimadzu Corporation, Јапан). Концентрација укупних растворљивих флавоноида у екстрактима узорака одређена је коришћењем калибрационе криве рутина (TCI America, Портланд, Орегон, САД), а затим изражена као милиграми еквивалента рутина по граму свеже тежине (mg RE g-1 свеже тежине).
Укупан садржај слободних аминокиселина у листовима пасуља одређен је коришћењем модификованог нинхидринског реагенса (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, САД) на основу методе коју су предложили Јокојама и Хираматсу (2003) и модификовали Сан и др. (2006). Укратко, 0,1 г млевеног ткива је екстраховано пуфером pH 5,4, а 200 μL супернатанта је реаговало са 200 μL нинхидрина (2%) и 200 μL пиридина (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, САД), инкубирано у кључалој воденој купељи 30 минута, затим охлађено и мерено на 580 nm коришћењем UV-160A спектрофотометра (Shimadzu Corporation, Јапан). С друге стране, пролин је одређен Бејтсовом методом (Bates et al., 1973). Пролин је екстрахован са 3% сулфосалицилном киселином (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, САД) и након центрифугирања, 0,5 ml супернатанта је помешано са 1 ml глацијалне сирћетне киселине (Fisher Scientific, Hampton, NH, САД) и нинхидринским реагенсом, инкубирано на 90°C током 45 минута, охлађено и мерено на 520 nm коришћењем истог спектрофотометра као горе. Укупне слободне аминокиселине и пролин у екстрактима листова одређени су коришћењем калибрационих кривих глицина и пролина (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, САД), респективно, и изражени као mg/g свеже тежине.
Да би се одредила ензимска активност антиоксидативних ензима, приближно 500 мг хомогенизованог ткива је екстраховано са 3 мл 50 mM Tris пуфера (pH 7,8) који садржи 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, САД) и 7,5% поливинилпиролидона (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, САД), центрифугирано на 10.000 × g током 20 минута у хлађењу (4 °C), а супернатант (сирови екстракт ензима) је сакупљен (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Каталаза (CAT) је затим реаговала са 2 ml 0,1 M натријум фосфатног пуфера (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, САД) и 100 μl раствора H2O2 од 269 mM да би се одредила њена ензимска активност према методи Aebi (1984) са мањим модификацијама (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ензимска активност гвајакол-зависне пероксидазе (POX) одређена је коришћењем методе Harrach et al. (2009). (2008) са мањим изменама (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) и ензимска активност полифенол оксидазе (PPO) је одређена након реакције са 2,2 ml 100 mM натријум фосфатног пуфера (pH 6,0), 100 μl гвајакола (TCI chemicals, Портланд, Орегон, САД) и 100 μl 12 mM H2O2. Метода је мало модификована у односу на (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Тест је извршен након реакције са 3 ml раствора катехола (Thermo Scientific Chemicals, Волтам, Масачусетс, САД) (0,01 M) свеже припремљеног у 0,1 M фосфатном пуферу (pH 6,0). CAT активност је мерена праћењем разградње H2O2 на 240 nm (A240), POX активност је мерена праћењем повећања апсорбанције на 436 nm (A436), а PPO активност је мерена снимањем флуктуација апсорбанције на 495 nm (A495) сваких 30 s током 3 мин коришћењем UV-160A спектрофотометра (Shimadzu, Јапан).
RT-PCR у реалном времену је коришћен за детекцију нивоа транскрипата три гена повезана са антиоксидантима, укључујући пероксизомалну каталазу (PvCAT1; GenBank приступни број KF033307.1), супероксид дисмутазу (PvSOD; GenBank приступни број XM_068639556.1) и глутатион редуктазу (PvGR; GenBank приступни број KY195009.1), у листовима пасуља (други и трећи потпуно развијени лист одозго) 72 сата након последњег третмана. Укратко, РНК је изолована коришћењем Simply P Total RNA Extraction Kit-а (кат. бр. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Кина) према протоколу произвођача. Затим је кДНК синтетизована коришћењем TOP script™ cDNA Synthesis Kit-а према упутствима произвођача. Секвенце прајмера горе наведена три гена су наведене у Додатној табели S3. PvActin-3 (GenBank приступни број: XM_068616709.1) је коришћен као ген за домаћинство, а релативна експресија гена је израчуната коришћењем 2-ΔΔCT методе (Livak и Schmittgen, 2001). Доказана је стабилност актина под биотским стресом (некомпатибилна интеракција између уобичајених махунарки и антракнозне гљивице Colletotrichum lindemuthianum) и абиотским стресом (суша, салинитет, ниска температура) (Borges et al., 2012).
Првобитно смо извршили in silico анализу целог генома протеина оксалоацетат ацетилхидролазе (OAH) код S. sclerotiorum користећи алатку протеин-протеин BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Укратко, користили смо OAH из Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; таксид: 1191702; GenBank приступни број XP_040799428.1; 342 аминокиселине) и Penicillium lagena (PlOAH; таксид: 94218; GenBank приступни број XP_056833920.1; 316 аминокиселина) као секвенце упита за мапирање хомологног протеина код S. sclerotiorum (таксид: 5180). BLASTp је спроведен на основу најновијих доступних података о геному S. sclerotiorum у GenBank-у на веб страници Националног центра за биотехнолошке информације (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Поред тога, предвиђени OAH ген из S. sclerotiorum (SsOAH) и еволуциона анализа и филогенетско стабло AfOAH из A. fijiensis CBS 313.89 и PlOAH из P. lagena су изведени коришћењем методе максималне вероватноће у MEGA11 (Tamura et al., 2021) и JTT модела заснованог на матрици (Jones et al., 1992). Филогенетско стабло је комбиновано са анализом вишеструког поравнања протеинских секвенци свих предвиђених OAH гена (SsOAH) из S. sclerotiorum и упитне секвенце коришћењем алата за поравнање засновано на ограничењима (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007). Поред тога, најбоље подударне аминокиселинске секвенце SsOAH из S. sclerotiorum су поравнате са упитним секвенцама (AfOAH и PlOAH) (Larkin et al., 2007) користећи ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), а конзервирани региони у поравнању су визуализовани помоћу алата ESPript (верзија 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Штавише, предвиђени функционални репрезентативни домени и конзервисана места S. sclerotiorum SsOAH су интерактивно класификовани у различите фамилије коришћењем алата InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Коначно, тродимензионално (3D) моделирање структуре предвиђеног S. sclerotiorum SsOAH је извршено коришћењем Protein Homology/Analogy Recognition Engine-а (Phyre2 сервер верзије 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) и валидирано коришћењем SWISS-MODEL сервера (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Предвиђене тродимензионалне структуре (PDB формат) су интерактивно визуализоване коришћењем UCSF-Chimera пакета (верзија 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Квантитативна флуоресцентна ПЦР у реалном времену коришћена је за одређивање транскрипционог нивоа оксалоацетат ацетилхидролазе (SsOAH; приступни број GenBank: XM_001590428.1) у мицелију Sclerotinia sclerotiorum. Укратко, S. sclerotiorum је инокулиран у боцу која садржи PDB и стављен у инкубатор на мућкању (модел: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, САД) на 25 ± 2 °C током 24 сата при 150 о/мин и у константном мраку (24 сата) како би се стимулисао раст мицелија. Након тога, ћелије су третиране L-орнитином и фунгицидом Rizolex-T у коначним концентрацијама IC50 (приближно 40 и 3,2 мг/Л, респективно), а затим култивисане још 24 сата под истим условима. Након инкубације, културе су центрифугиране на 2500 о/мин током 5 минута, а супернатант (гљивични мицелијум) је сакупљен за анализу експресије гена. Слично томе, гљивични мицелијум је сакупљен на 0, 24, 48, 72, 96 и 120 сати након инфекције из заражених биљака које су формирале белу плесан и памукасти мицелијум на површини заражених ткива. РНК је екстрахована из гљивичног мицелијума, а затим је цДНК синтетизована као што је горе описано. Прајмерне секвенце за SsOAH су наведене у Додатној табели С3. SsActin (GenBank приступни број: XM_001589919.1) је коришћен као главни ген, а релативна експресија гена је израчуната коришћењем 2-ΔΔCT методе (Livak и Schmittgen, 2001).
Оксална киселина је одређена у бујону од декстрозе кромпира (PDB) и узорцима биљака који садрже гљивични патоген Sclerotinia sclerotiorum према методи Xu и Zhang (2000) са мањим модификацијама. Укратко, изолати S. sclerotiorum су инокулирани у боце које садрже PDB, а затим култивисани у инкубатору на мућкању (модел I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, САД) при 150 обртаја у минути на 25 ± 2 °C током 3–5 дана у сталном мраку (24 сата) како би се стимулисао раст мицелијума. Након инкубације, гљивична култура је прво филтрирана кроз Whatman #1 филтер папир, а затим центрифугирана при 2500 обртаја у минути током 5 минута како би се уклонио преостали мицелијум. Супернатант је сакупљен и чуван на 4°C за даље квантитативно одређивање оксалата. За припрему узорака биљака, приближно 0,1 г фрагмената биљног ткива је екстраховано три пута дестилованом водом (по 2 ml сваки пут). Узорци су затим центрифугирани на 2500 о/мин током 5 минута, супернатант је суво филтриран кроз Whatman No. 1 филтер папир и сакупљен за даљу анализу.
За квантитативну анализу оксалне киселине, реакциона смеша је припремљена у стакленој епрувети са зачепљеним чепом следећим редоследом: 0,2 ml узорка (или филтрата PDB културе или стандардног раствора оксалне киселине), 0,11 ml бромофенол плавог (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, САД), 0,198 ml 1 M сумпорне киселине (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каиро, Египат) и 0,176 ml 100 mM калијум дихромата (K2Cr2O7; TCI chemicals, Портланд, OR, САД), а затим је раствор разблажен до 4,8 ml дестилованом водом, енергично промешан и одмах стављен у водено купатило на 60 °C. Након 10 минута, реакција је заустављена додавањем 0,5 ml раствора натријум хидроксида (NaOH; 0,75 M). Апсорбанција (A600) реакционе смеше је мерена на 600 nm коришћењем UV-160 спектрофотометра (Shimadzu Corporation, Јапан). PDB и дестилована вода су коришћени као контроле за квантификацију филтрата културе и узорака биљака, респективно. Концентрације оксалне киселине у филтратима културе, изражене као микрограми оксалне киселине по милилитру PDB медијума (μg.mL−1), и у екстрактима листова, изражене као микрограми оксалне киселине по граму свеже тежине (μg.g−1 FW), одређене су коришћењем калибрационе криве оксалне киселине (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, САД).
Током студије, сви експерименти су осмишљени по потпуно рандомизованом дизајну (CRD) са шест биолошких понављања по третману и пет саксија по биолошком понављању (две биљке по саксији), осим ако није другачије назначено. Биолошка понављања су анализирана у дупликату (два техничка понављања). Техничка понављања су коришћена за проверу репродуктивности истог експеримента, али нису коришћена у статистичкој анализи како би се избегла лажна понављања. Подаци су статистички анализирани коришћењем анализе варијансе (ANOVA), након чега је уследио Туки-Крамеров тест значајне разлике (HSD) (p ≤ 0,05). За in vitro експерименте, вредности IC50 и IC99 су израчунате коришћењем пробит модела и израчунати су 95% интервали поверења.
Укупно четири изолата су сакупљена са различитих поља соје у губернији Ел Габија, Египат. На ПДА медијуму, сви изолати су произвели кремасто бели мицелијум који је брзо постао памучно бео (Слика 1А), а затим беж или смеђ у фази склероцијума. Склероције су обично густе, црне, сферног или неправилног облика, дугачке 5,2 до 7,7 мм и пречника 3,4 до 5,3 мм (Слика 1Б). Иако су четири изолата развила маргинални образац склероција на ивици медијума за култивацију након 10–12 дана инкубације на 25 ± 2 °C (Слика 1А), број склероција по плочи се значајно разликовао међу њима (P < 0,001), при чему је изолат 3 имао највећи број склероција (32,33 ± 1,53 склероција по плочи; Слика 1Ц). Слично томе, изолат бр. 3 је произвео више оксалне киселине у PDB него други изолати (3,33 ± 0,49 μг.мл−1; Сл. 1Д). Изолат бр. 3 је показао типичне морфолошке и микроскопске карактеристике фитопатогене гљивице Sclerotinia sclerotiorum. На пример, на PDA, колоније изолата бр. 3 су брзо расле, биле су кремасто беле (Слика 1А), обрнуто беж или светло лосос жуто-смеђе боје, и било им је потребно 6-7 дана на 25 ± 2°C да потпуно покрију површину плоче пречника 9 цм. На основу горе наведених морфолошких и микроскопских карактеристика, изолат бр. 3 је идентификован као Sclerotinia sclerotiorum.
Слика 1. Карактеристике и патогеност изолата S. sclerotiorum из уобичајених усева махунарки. (А) Раст мицелија четири изолата S. sclerotiorum на PDA медијуму, (Б) склероције четири изолата S. sclerotiorum, (Ц) број склероција (по плочи), (Д) секреција оксалне киселине на PDB медијуму (μг.мл−1) и (Е) тежина болести (%) четири изолата S. sclerotiorum на осетљивом комерцијалном култивару махунарки Giza 3 у условима стаклене баште. Вредности представљају средњу вредност ± SD пет биолошких понављања (n = 5). Различита слова означавају статистички значајне разлике између третмана (p < 0,05). (Ф–Х) Типични симптоми беле плесни појавили су се на надземним стабљикама и силикима, респективно, 10 дана након инокулације изолата бр. 3 (dpi). (I) Еволуциона анализа региона интерног транскрибованог размакног сегмента (ITS) изолата #3 S. sclerotiorum спроведена је коришћењем методе максималне вероватноће и упоређена са 20 референтних изолата/сојева добијених из базе података Националног центра за биотехнолошке информације (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Бројеви изнад линија груписања означавају покривеност региона (%), а бројеви испод линија груписања означавају дужину гране.
Штавише, да би се потврдила патогеност, четири добијена изолата S. sclerotiorum коришћена су за инокулацију осетљивог комерцијалног сорте пасуља Giza 3 у условима стаклене баште, што је у складу са Коховим постулатима (Сл. 1Е). Иако су сви добијени гљивични изолати били патогени и могли су да инфицирају зелени пасуљ (сорта Giza 3), узрокујући типичне симптоме беле плесни на свим надземним деловима (Сл. 1Ф), посебно на стабљикама (Сл. 1Г) и махунама (Сл. 1Х) 10 дана након инокулације (dpi), изолат 3 је био најагресивнији изолат у два независна експеримента. Изолат 3 је имао највећу тежину болести (%) на биљкама пасуља (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 и 76,7 ± 3,1 на 7, 14 и 21 дан након инфекције, респективно; Слика 1Ф).
Идентификација најинвазивнијег изолата S. sclerotiorum #3 додатно је потврђена на основу секвенцирања интерног транскрибованог размакног чвора (ITS) (Сл. 1I). Филогенетска анализа између изолата #3 и 20 референтних изолата/сојева показала је високу сличност (>99%) између њих. Вреди напоменути да изолат S. sclerotiorum #3 (533 bp) има високу сличност са америчким изолатом S. sclerotiorum LPM36 изолованим из сувог семена грашка (GenBank приступни број MK896659.1; 540 bp) и кинеским изолатом S. sclerotiorum YKY211 (GenBank приступни број OR206374.1; 548 bp), који изазива трулеж стабљике љубичице (Matthiola incana), а сви су груписани одвојено на врху дендрограма (Слика 1I). Нова секвенца је депонована у бази података NCBI и названа „Sclerotinia sclerotiorum – изолат YN-25“ (GenBank приступни број PV202792). Може се видети да је изолат 3 најинвазивнији изолат; стога је овај изолат изабран за проучавање у свим наредним експериментима.
Антибактеријска активност диамина L-орнитина (Sigma-Aldrich, Дармштат, Немачка) у различитим концентрацијама (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 мг/Л) против изолата 3 S. sclerotiorum испитивана је in vitro. Важно је напоменути да је L-орнитин испољио антибактеријски ефекат и постепено инхибирао радијални раст хифа S. sclerotiorum на начин зависан од дозе (слика 2А, Б). При највишој тестираној концентрацији (125 мг/Л), L-орнитин је показао највећу стопу инхибиције раста мицелија (99,62 ± 0,27%; слика 2Б), што је било еквивалентно комерцијалном фунгициду Rizolex-T (стопа инхибиције 99,45 ± 0,39%; слика 2Ц) при највишој тестираној концентрацији (10 мг/Л), што указује на сличну ефикасност.
Слика 2. Ин витро антибактеријска активност Л-орнитина против Sclerotinia sclerotiorum. (А) Поређење антибактеријске активности различитих концентрација Л-орнитина против S. sclerotiorum са комерцијалним фунгицидом Rizolex-T (10 мг/Л). (Б, Ц) Стопа инхибиције (%) раста мицелија S. sclerotiorum након третмана различитим концентрацијама Л-орнитина (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 мг/Л) или Rizolex-T (2, 4, 6, 8 и 10 мг/Л), респективно. Вредности представљају средњу вредност ± SD пет биолошких понављања (n = 5). Различита слова означавају статистичке разлике између третмана (p < 0,05). (Д, Е) Пробит модел регресионе анализе Л-орнитина и комерцијалног фунгицида Rizolex-T, респективно. Регресиона линија пробит модела је приказана као пуна плава линија, а интервал поверења (95%) је приказан као испрекидана црвена линија.
Поред тога, спроведена је пробит регресиона анализа и одговарајући графикони су приказани у Табели 1 и сликама 2Д,Е. Укратко, прихватљива вредност нагиба (y = 2,92x − 4,67) и повезана значајна статистика (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 и p < 0,0001; Слика 2Д) Л-орнитина указују на појачану антифунгичну активност против S. sclerotiorum у поређењу са комерцијалним фунгицидом Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 и p < 0,0001) (Табела 1).
Табела 1. Вредности полумаксималне инхибиторне концентрације (IC50) и IC99 (mg/l) L-орнитина и комерцијалног фунгицида „Rizolex-T“ против S. sclerotiorum.
Генерално, Л-орнитин (250 мг/Л) значајно је смањио развој и тежину беле плесни на третираним биљкама пасуља у поређењу са нетретираним биљкама зараженим S. sclerotiorum (контрола; Слика 3А). Укратко, иако се тежина болести код нетретираних заражених контролних биљака постепено повећавала (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 и 92,33 ± 3,06%), Л-орнитин је значајно смањио тежину болести (%) током целог експеримента (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 и 26,36 ± 3,07) 7, 14 и 21 дан након третмана (dpt), респективно (Слика 3А). Слично томе, када су биљке пасуља заражене S. sclerotiorum третиране са 250 мг/Л Л-орнитина, површина испод криве прогресије болести (AUDPC) се смањила са 1274,33 ± 33,13 код нетретиране контроле на 281,03 ± 7,95, што је било нешто ниже од површине код позитивне контроле фунгицида Rizolex-T од 50 мг/Л (183,61 ± 7,71; Сл. 3Б). Исти тренд је примећен и у другом експерименту.
Сл. 3. Ефекат егзогене примене Л-орнитина на развој беле трулежи пасуља изазване Sclerotinia sclerotiorum у условима стаклене баште. (А) Крива прогресије болести беле плесни пасуља након третмана са 250 мг/Л Л-орнитина. (Б) Површина испод криве прогресије болести (AUDPC) беле плесни пасуља након третмана Л-орнитином. Вредности представљају средњу вредност ± SD пет биолошких понављања (n = 5). Различита слова означавају статистички значајне разлике између третмана (p < 0,05).
Егзогена примена 250 мг/Л Л-орнитина постепено је повећавала висину биљке (Сл. 4А), број грана по биљци (Сл. 4Б) и број листова по биљци (Сл. 4Ц) након 42 дана. Док је комерцијални фунгицид Ризолекс-Т (50 мг/Л) имао највећи ефекат на све проучаване нутритивне параметре, егзогена примена 250 мг/Л Л-орнитина имала је други највећи ефекат у поређењу са нетретираним контролама (Сл. 4А–Ц). С друге стране, третман Л-орнитином није имао значајан утицај на садржај фотосинтетских пигмената хлорофила а (Сл. 4Д) и хлорофила б (Сл. 4Е), али је благо повећао укупан садржај каротеноида (0,56 ± 0,03 мг/г свеже тежине) у поређењу са негативном контролом (0,44 ± 0,02 мг/г свеже тежине) и позитивном контролом (0,46 ± 0,02 мг/г свеже тежине; Сл. 4Ф). Генерално, ови резултати указују да Л-орнитин није фитотоксичан за третиране махунарке и чак може стимулисати њихов раст.
Сл. 4. Утицај примене егзогеног L-орнитина на карактеристике раста и фотосинтетске пигменте листова пасуља заражених са Sclerotinia sclerotiorum у условима стаклене баште. (А) Висина биљке (цм), (Б) Број грана по биљци, (Ц) Број листова по биљци, (Д) Садржај хлорофила а (мг г-1 свеже тежине), (Е) Садржај хлорофила б (мг г-1 свеже тежине), (Ф) Укупан садржај каротеноида (мг г-1 свеже тежине). Вредности представљају средњу вредност ± стандардну девијацију пет биолошких понављања (н = 5). Различита слова означавају статистички значајне разлике између третмана (п < 0,05).
Хистохемијска локализација реактивних врста кисеоника (ROS; изражених као водоник-пероксид [H2O2]) и слободних радикала (изражених као супероксидни ањони [O2•−]) in situ показала је да је егзогена примена L-орнитина (250 mg/L) значајно смањила акумулацију H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Сл. 5A) и O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Сл. 5B) у поређењу са акумулацијом и нетретираних заражених биљака (173,31 ± 12,06 и 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, респективно) и биљака третираних са 50 mg/L комерцијалног фунгицида Rizolex-T (170,12 ± 9,50 и 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, респективно) након 72 сата. Високи нивои H2O2 и O2•− акумулирали су се под утицајем високог термичког оптерећења (hpt) (Сл. 5А, Б). Слично томе, тест малондиалдехида (MDA) заснован на TCA показао је да су биљке пасуља заражене S. sclerotiorum акумулирале веће нивое MDA (113,48 ± 10,02 nmol·g fr wt) у својим листовима (Сл. 5C). Међутим, егзогена примена L-орнитина значајно је смањила липидну пероксидацију, што је доказано смањењем садржаја MDA у третираним биљкама (33,08 ± 4,00 nmol·g fr wt).
Сл. 5. Ефекат егзогене примене L-орнитина на главне маркере оксидативног стреса и неензимске антиоксидативне одбрамбене механизме у листовима пасуља инфицираним са S. sclerotiorum 72 сата након инфекције у условима стаклене баште. (А) Водоник-пероксид (H2O2; nmol g−1 FW) на 72 hpt, (Б) супероксидни анјон (O2•−; nmol g−1 FW) на 72 hpt, (Ц) малондиалдехид (MDA; nmol g−1 FW) на 72 hpt, (Д) укупни растворљиви феноли (mg GAE g−1 FW) на 72 hpt, (Е) укупни растворљиви флавоноиди (mg RE g−1 FW) на 72 hpt, (Ф) укупне слободне аминокиселине (mg g−1 FW) на 72 hpt и (Г) садржај пролина (mg g−1 FW) на 72 hpt. Вредности представљају средњу вредност ± стандардну девијацију (средња вредност ± SD) 5 биолошких понављања (n = 5). Различита слова означавају статистички значајне разлике између третмана (p < 0,05).