Различите теорије одбране биљака пружају важне теоријске смернице за објашњење образаца специјализованог метаболизма биљака, али њихова кључна предвиђања тек треба да се тестирају. Овде смо користили непристрасну тандемску анализу масене спектрометрије (MS/MS) да бисмо систематски истражили метаболом атенуираних сојева дувана од појединачних биљака до популација и блиско сродних врста, и обрадили велики број теорија карактеристика масене спектрометрије заснованих на јединственим спектрима у информацијама. Оквир за тестирање кључних предвиђања теорија оптималне одбране (OD) и покретних мета (MT). Информациона компонента метаболомике биљака је у складу са OD теоријом, али је у супротности са главним предвиђањем MT теорије о динамици метаболомике коју изазивају биљоједи. Од микро до макро еволуционе скале, сигнал јасмоната је идентификован као главна детерминанта OD, док је сигнал етилена обезбедио фино подешавање одговора специфичног за биљоједе, анотираног MS/MS молекуларном мрежом.
Специјални метаболити са различитим структурама су главни учесници у адаптацији биљака на околину, посебно у одбрани од непријатеља (1). Невероватна диверзификација специјалног метаболизма који се налази код биљака подстакла је деценије дубинских истраживања његових многих аспеката еколошких функција и формирала је дугачку листу теорија одбране биљака, које представљају еволутивни и еколошки развој интеракција биљака и инсеката. Емпиријска истраживања пружају важне смернице (2). Међутим, ове теорије одбране биљака нису пратиле нормативни пут хипотетичког дедуктивног резоновања, у којем су кључна предвиђања била на истом нивоу анализе (3) и експериментално су тестирана како би се унапредио следећи циклус теоријског развоја (4). Техничка ограничења ограничавају прикупљање података на специфичне метаболичке категорије и искључују свеобухватну анализу специјализованих метаболита, чиме се спречавају међукатегоријска поређења која су неопходна за теоријски развој (5). Недостатак свеобухватних метаболомичких података и заједничке валуте за поређење тока обраде метаболичког простора између различитих биљних група омета научну зрелост ове области.
Најновија достигнућа у области метаболомике тандемске масене спектрометрије (MS/MS) могу свеобухватно окарактерисати метаболичке промене унутар и између врста датог системског клада и могу се комбиновати са рачунарским методама за израчунавање структурне сличности између ових сложених смеша. Предзнање хемије (5). Комбинација напредних технологија у анализи и рачунарству пружа неопходан оквир за дугорочно тестирање многих предвиђања еколошке и еволуционе теорије метаболичке разноликости. Шенон (6) је први пут представио теорију информација у свом капиталном чланку 1948. године, постављајући темеље за математичку анализу информација, која је коришћена у многим областима осим у својој првобитној примени. У геномици, теорија информација је успешно примењена за квантификацију конзервативних информација о секвенцама (7). У истраживањима транскриптомике, теорија информација анализира укупне промене у транскриптому (8). У претходним истраживањима, применили смо статистички оквир теорије информација на метаболомику како бисмо описали метаболичку експертизу на нивоу ткива код биљака (9). Овде комбинујемо ток рада заснован на MS/MS са статистичким оквиром теорије информација, коју карактерише метаболичка разноликост у заједничкој валути, како бисмо упоредили кључна предвиђања теорије одбране биљака метаболома индукованог биљоједима.
Теоријски оквири одбране биљака су обично међусобно инклузивни и могу се поделити у две категорије: оне које покушавају да објасне дистрибуцију метаболита специфичних за биљке на основу одбрамбених функција, као што су оптимална одбрана (ОД) (10), теорија покретне мете (МТ) (11) и теорија изгледа (12), док друге траже механичка објашњења о томе како промене у доступности ресурса утичу на раст биљака и акумулацију специјализованих метаболита, као што су хипотеза о равнотежи угљеника и хранљивих материја (13), хипотеза о брзини раста (14) и хипотеза о равнотежи раста и диференцијације (15). Два скупа теорија су на различитим нивоима анализе (4). Међутим, две теорије које укључују одбрамбене функције на функционалном нивоу доминирају разговором о конститутивној и индуцибилној одбрани биљака: ОД теорија, која претпоставља да биљке улажу у своју скупу хемијску одбрану само када је то потребно, на пример, када се прогутају. Када травната животиња нападне, стога се, према могућности будућег напада, додељује једињење са одбрамбеном функцијом (10); МТ хипотеза предлаже да не постоји оса усмерене промене метаболита, већ се метаболит мења насумично, стварајући тако могућност ометања метаболичке „мете кретања“ нападајућих биљоједа. Другим речима, ове две теорије дају супротна предвиђања о метаболичком ремоделирању које се дешава након напада биљоједа: однос између једносмерне акумулације метаболита са одбрамбеном функцијом (ОД) и неусмерених метаболичких промена (МТ) (11).
Хипотезе о ОД и МТ не укључују само индуковане промене у метаболому, већ и еколошке и еволутивне последице акумулације ових метаболита, као што су адаптивни трошкови и користи ових метаболичких промена у специфичном еколошком окружењу (16). Иако обе хипотезе препознају одбрамбену функцију специјализованих метаболита, који могу, али и не морају бити скупи, кључно предвиђање које разликује хипотезе о ОД и МТ лежи у усмерености индукованих метаболичких промена. Предвиђање теорије о ОД је до сада добило највише експерименталне пажње. Ови тестови укључују проучавање директних или индиректних одбрамбених функција различитих ткива специфичних једињења у пластеницима и природним условима, као и промене у фази развоја биљака (17-19). Међутим, до сада, због недостатка тока рада и статистичког оквира за глобалну свеобухватну анализу метаболичке разноликости било ког организма, главна разлика у предвиђању између две теорије (то јест, смер метаболичких промена) остаје да се тестира. Овде пружамо такву анализу.
Једна од најзначајнијих карактеристика биљно-специфичних метаболита је њихова екстремна структурна разноликост на свим нивоима, од појединачних биљака, популација до сличних врста (20). Многе квантитативне промене у специјализованим метаболитима могу се посматрати на нивоу популације, док се јаке квалитативне разлике обично одржавају на нивоу врсте (20). Стога је метаболичка разноликост биљака главни аспект функционалне разноликости, што одражава прилагодљивост различитим нишама, посебно оним нишама са различитим могућностима инвазије од стране посебних инсеката и уобичајених биљоједа (21). Од Френкеловог (22) револуционарног чланка о разлозима за постојање биљно-специфичних метаболита, интеракције са различитим инсектима сматране су важним селекционим притисцима, и верује се да су ове интеракције обликовале биљке током еволуције. Метаболички пут (23). Међуврсне разлике у разноликости специјализованих метаболита могу такође одражавати физиолошку равнотежу повезану са конститутивном и индуцибилном одбраном биљака од биљоједних стратегија, јер су две врсте често негативно корелиране једна са другом (24). Иако може бити корисно одржавати добру одбрану у сваком тренутку, благовремене метаболичке промене повезане са одбраном пружају јасне користи јер омогућавају биљкама да издвоје вредне ресурсе у друга физиолошка улагања (19, 24) и избегну потребу за симбиозом. Колатерална штета (25). Поред тога, ове реорганизације специјализованих метаболита изазване инсектима биљоједима могу довести до деструктивне дистрибуције у популацији (26) и могу одражавати директна очитавања значајних природних промена у сигналу јасмонске киселине (JA), који се може одржати у популацији. Високи и ниски JA сигнали су компромиси између одбране од биљоједа и конкуренције са одређеним врстама (27). Поред тога, специјализовани биосинтетски путеви метаболита ће претрпети брзе губитке и трансформације током еволуције, што ће резултирати неуједначеном метаболичком дистрибуцијом међу блиско сродним врстама (28). Ови полиморфизми се могу брзо успоставити као одговор на променљиве обрасце биљоједа (29), што значи да је флуктуација заједница биљоједа кључни фактор који покреће метаболичку хетерогеност.
Овде смо конкретно решили следеће проблеме. (I) Како биљојед инсект реконфигурише биљни метаболом? (Ii) Које су главне информационе компоненте метаболичке пластичности које се могу квантификовати да би се тестирала предвиђања теорије дугорочне одбране? (Iii) Да ли репрограмирати биљни метаболом на начин јединствен за нападача, ако јесте, какву улогу игра биљни хормон у прилагођавању специфичног метаболичког одговора и који метаболити доприносе специфичности одбране врсте? (Iv) Пошто се предвиђања многих теорија одбране могу проширити на све нивое биолошких ткива, питали смо се колико је конзистентан изазвани метаболички одговор од интерног поређења до интерспецијског поређења? У том циљу, систематски смо проучавали метаболом листа никотина у дувану, који је еколошки модел биљке са богатим специјализованим метаболизмом и ефикасан је против ларви два аутохтона биљоједа, Lepidoptera Datura (Ms) (веома агресивна, углавном се једе). На Solanaceae и Spodoptera littoralis (Sl), црви листа памука су нека врста „рода“, са биљкама домаћинима Solanaceae и другим домаћинима других родова и породица које се хране биљкама. Анализирали смо MS/MS метаболомички спектар и извукли статистичке дескрипторе теорије информација како бисмо упоредили теорије OD и MT. Направили смо мапе специфичности како бисмо открили идентитет кључних метаболита. Анализа је проширена на аутохтону популацију N. nasi и блиско сродних врста дувана како би се даље анализирала коваријанса између сигнализације биљних хормона и индукције OD.
Да бисмо добили свеобухватну мапу пластичности и структуре метаболома листа биљоједог дувана, користили смо претходно развијени ток анализе и израчунавања како бисмо свеобухватно прикупили и деконволуирали MS/MS спектре високе резолуције независне од података из биљних екстраката (9). Ова недиференцирана метода (названа MS/MS) може конструисати нередундантне спектре једињења, који се затим могу користити за све анализе на нивоу једињења описане овде. Ови деконволуирани биљни метаболити су различитих типова, који се састоје од стотина до хиљада метаболита (овде око 500-1000-s/MS/MS). Овде разматрамо метаболичку пластичност у оквиру теорије информација и квантификујемо разноликост и професионализам метаболома на основу Шенонове ентропије дистрибуције метаболичке фреквенције. Користећи претходно имплементирану формулу (8), израчунали смо скуп индикатора који се могу користити за квантификацију разноликости метаболома (Hj индикатор), специјализације метаболичког профила (δj индикатор) и метаболичке специфичности једног метаболита (Si индикатор). Поред тога, применили смо индекс релативне пластичности удаљености (RDPI) да бисмо квантификовали индуцибилност метаболома биљоједа (Слика 1А) (30). У оквиру овог статистичког оквира, третирамо MS/MS спектар као основну информациону јединицу и обрађујемо релативну количину MS/MS у мапу расподеле фреквенција, а затим користимо Шенонову ентропију да проценимо разноврсност метаболома из ње. Специјализација метаболома се мери просечном специфичношћу једног MS/MS спектра. Стога се повећање количине неких MS/MS класа након индукције биљоједа трансформише у спектралну индуцибилност, RDPI и специјализацију, односно повећање δj индекса, јер се производе специјализованији метаболити и производи се висок Si индекс. Смањење Hj индекса разноврсности одражава да се или смањује број генерисаних MS/MS или се дистрибуција фреквенција профила мења у мање уједначеном смеру, уз смањење њене укупне несигурности. Кроз израчунавање Si индекса, могуће је истакнути које MS/MS индукују одређени биљоједи, а напротив, које MS/MS не реагују на индукцију, што је кључни индикатор за разликовање предвиђања MT и OD.
(А) Статистички дескриптори који се користе за индуцибилност података (RDPI) MS/MS код биљоједа (H1 до Hx), разноврсност (Hj индекс), специјализацију (δj индекс) и специфичност метаболита (Si индекс). Повећање степена специјализације (δj) указује да ће се, у просеку, производити више метаболита специфичних за биљоједе, док смањење разноврсности (Hj) указује на смањење производње метаболита или неравномерну расподелу метаболита на мапи дистрибуције. Вредност Si процењује да ли је метаболит специфичан за дато стање (овде, биљојед) или је обрнуто одржаван на истом нивоу. (Б) Концептуални дијаграм предвиђања теорије одбране коришћењем осе теорије информација. OD теорија предвиђа да ће напад биљоједа повећати метаболите одбране, чиме ће се повећати δj. Истовремено, Hj се смањује јер се профил реорганизује ка смањеној несигурности метаболичких информација. MT теорија предвиђа да ће напад биљоједа изазвати неусмерене промене у метаболому, чиме ће се повећати Hj као индикатор повећане несигурности метаболичких информација и изазвати случајну расподелу Si. Такође смо предложили мешовити модел, најбољи МТ, у коме ће неки метаболити са вишим одбрамбеним вредностима бити посебно повећани (висока вредност Si), док ће други показивати случајне одговоре (нижа вредност Si).
Користећи дескрипторе теорије информација, тумачимо теорију ОД како бисмо предвидели да ће промене посебних метаболита изазване биљоједима у неиндукованом конститутивном стању довести до (i) повећања метаболичке специфичности (Si индекс) што покреће метабономску специфичност (δj индекс) (повећање) одређених група посебних метаболита са вишом одбрамбеном вредношћу и (ii) смањења разноликости метаболома (Hj индекс) због промене дистрибуције метаболичке фреквенције ка дистрибуцији лептинских тела. На нивоу једног метаболита, очекује се уређена дистрибуција Si, где ће метаболит повећати вредност Si у складу са својом одбрамбеном вредношћу (Слика 1Б). У том смислу, објашњавамо МТ теорију како бисмо предвидели да ће побуђивање довести до (i) неусмерених промена у метаболитима што ће резултирати смањењем δj индекса и (ii) повећања Hj индекса због повећања метаболичке несигурности, или случајности, која се може квантификовати Шеноновом ентропијом у облику генерализоване разноликости. Што се тиче метаболичког састава, МТ теорија ће предвидети случајну дистрибуцију Si. Узимајући у обзир да се одређени метаболити налазе под специфичним условима, а други услови нису, и да њихова одбрамбена вредност зависи од окружења, предложили смо и модел мешовите одбране, у коме су δj и Hj распоређени у два правца дуж Si. Повећањем у свим правцима, само ће одређене групе метаболита, које имају веће одбрамбене вредности, посебно повећати Si, док ће други имати случајну расподелу (Слика 1Б).
Да бисмо тестирали предвиђање редефинисане теорије одбране на оси дескриптора теорије информација, подигли смо ларве биљоједа експертског (Ms) или генералистичког (Sl) типа на листовима Nepenthes pallens (слика 2А). Користећи MS/MS анализу, добили смо 599 нередундантних MS/MS спектара (датотека података S1) из метанолних екстраката ткива листа сакупљених након храњења гусеница. Коришћење RDPI, Hj и δj индекса за визуелизацију реконфигурације информационог садржаја у MS/MS конфигурационим датотекама открива занимљиве обрасце (слика 2Б). Општи тренд је да, како је описано информационим дескриптором, како гусенице настављају да једу лишће, степен све метаболичке реорганизације се повећава током времена: 72 сата након што биљојед једе, RDPI значајно расте. У поређењу са неоштећеном контролом, Hj је значајно смањен, што је било због повећаног степена специјализације метаболичког профила, који је квантификован δj индексом. Овај очигледни тренд је у складу са предвиђањима OD теорије, али је нескладан са главним предвиђањима MT теорије, која верује да се случајне (неусмерене) промене у нивоима метаболита користе као одбрамбена камуфлажа (Слика 1Б). Иако су садржај елиситора оралне секреције (OS) и понашање у исхрани код ова два биљоједа различити, њихово директно храњење је резултирало сличним променама у правцима Hj и δj током 24-часовног и 72-часовног периода жетве. Једина разлика се јавила након 72 сата RDPI. У поређењу са оним изазваним храњењем Ms, укупни метаболизам индукован храњењем Sl био је виши.
(А) Експериментални дизајн: биљоједи обичне свиње (С1) или стручњаци (Мс) хране се десалинизованим листовима биљака врча, док се за симулирану биљоједност, ОС Мс (В + ОСМс) користи за руковање убодом стандардизованих позиција листа. С1 (В + ОССл) ларве или вода (В + В). Контрола (Ц) је неоштећени лист. (Б) Индекс индуцибилности (РДПИ у поређењу са контролном картом), разноликости (Хј индекс) и специјализације (δј индекс) израчунат за мапу специјалних метаболита (599 МС/МС; датотека са подацима С1). Звездице означавају значајне разлике између директног храњења биљоједа и контролне групе (Студентов т-тест са упареним т-тестом, *П<0,05 и ***П<0,001). нс, није важно. (Ц) Индекс временске резолуције главног (плави оквир, аминокиселина, органска киселина и шећер; датотека података С2) и спектра специјалних метаболита (црвени оквир 443 MS/MS; датотека података С1) након симулираног третмана биљоједима. Трака у боји се односи на интервал поверења од 95%. Звездица означава значајну разлику између третмана и контроле [квадратна анализа варијансе (ANOVA), праћена Тукијевом значајном разликом (HSD) за post hoc вишеструка поређења, *P<0,05, **P<0,01 и *** P <0,001]. (Д) Специјализација дијаграма расејања и профила специјалних метаболита (поновљени узорци са различитим третманима).
Да бисмо истражили да ли се ремоделирање изазвано биљоједима на нивоу метаболома одражава у променама нивоа појединачних метаболита, прво смо се фокусирали на метаболите који су претходно проучавани у листовима Nepenthes pallens са доказаном отпорношћу на биљоједе. Фенолни амиди су конјугати хидроксицинамамида и полиамина који се акумулирају током процеса биљоједства код инсеката и познато је да смањују њихове перформансе (32). Претражили смо прекурсоре одговарајућих MS/MS и направили графикон њихових кумулативних кинетичких кривих (слика S1). Није изненађујуће да су деривати фенола који нису директно укључени у одбрану од биљоједа, као што су хлорогенска киселина (CGA) и рутин, смањени након биљоједства. Насупрот томе, биљоједи могу учинити фенол амиде веома потентним. Континуирано храњење два биљоједа резултирало је готово истим спектром побуђивања феноламида, а овај образац је био посебно очигледан за de novo синтезу феноламида. Исти феномен ће се приметити приликом истраживања пута 17-хидроксигеранил нонандиол дитерпенских гликозида (17-HGL-DTGs), који производи велики број ацикличних дитерпена са ефикасним анти-хербиворним функцијама (33), од којих је храњење Ms са Sl покренуло сличан профил експресије (слика S1).
Могући недостатак експеримената директног храњења биљоједа је разлика у брзини конзумирања лишћа и времену храњења биљоједа, што отежава елиминисање ефеката специфичних за биљоједе изазваних ранама и биљоједима. Да бисмо боље решили специфичност индукованог метаболичког одговора листа код биљоједа, симулирали смо храњење ларви Ms и Sl тако што смо одмах применили свеже сакупљени OS (OSM и OSS1) на стандардну пункцију W конзистентних положаја листа. Ова процедура се назива W + OS третман и стандардизује индукцију прецизним мерењем почетка одговора који изазива биљојед, а да притом не изазове збуњујуће ефекте разлика у брзини или количини губитка ткива (Слика 2А) (34). Користећи MS/MS анализу и прорачунски цевовод, добили смо 443 MS/MS спектра (датотека података S1), који су се преклапали са спектрима претходно састављеним из експеримената директног храњења. Анализа теорије информација овог MS/MS скупа података показала је да репрограмирање метаболома специјализованих за лист симулацијом биљоједа показује OS-специфичне индукције (Слика 2C). Посебно, у поређењу са третманом OSS1, OSM је изазвао појачање специјализације метаболома након 4 сата. Вреди напоменути да је, у поређењу са експерименталним скупом података о директном храњењу биљоједа, метаболичка кинетика визуализована у дводимензионалном простору коришћењем Hj и δj као координата, а усмереност специјализације метаболома као одговор на симулирани третман биљоједа током времена конзистентно расла (Слика 2D). Истовремено, квантификовали смо садржај аминокиселина, органских киселина и шећера (датотека података S2) како бисмо истражили да ли је ово циљано повећање стручности метаболома последица реконфигурације централног метаболизма угљеника као одговор на симулиране биљоједе (Слика S2). Да бисмо боље објаснили овај образац, даље смо пратили кинетику метаболичке акумулације претходно дискутованих путева феноламида и 17-HGL-DTG. ОС-специфична индукција биљоједа трансформише се у диференцијални образац преуређења унутар метаболизма феноламида (Слика S3). Фенолни амиди који садрже кумарин и кафеоилне групе преференцијално се индукују помоћу OSS1, док OSM покрећу специфичну индукцију ферулил коњугата. За 17-HGL-DTG пут, откривена је диференцијална индукција OS низводним производима малонилације и дималонилације (слика S3).
Затим, проучавали смо пластичност транскриптома индуковану ОС користећи скуп података микрочипова временског тока, који симулира употребу ОСМ-ова за третирање листова биљке розете код биљоједа. Кинетика узорковања се у основи преклапа са кинетиком коришћеном у овој студији метаболомике (35). У поређењу са реконфигурацијом метаболома у којој је метаболичка пластичност посебно повећана током времена, посматрамо пролазне транскрипционе експлозије у листовима изазване Мс, где су индуцибилност транскриптома (RDPI) и специјализација (δj) на 1. Дошло је до значајног повећања сати и разноликости (Hj) у овом временском тренутку, експресија БМП1 је значајно смањена, након чега је уследило опуштање специјализације транскриптома (Слика С4). Метаболичке генске породице (као што су П450, гликозилтрансфераза и БАХД ацилтрансфераза) учествују у процесу склапања посебних метаболита из структурних јединица изведених из примарног метаболизма, пратећи горе поменути рани модел високе специјализације. Као студија случаја, анализиран је пут фенилаланина. Анализа је потврдила да су основни гени у метаболизму феноламида високо индуковани ОС-ом код биљоједа у поређењу са биљкама које нису привучене, и да су уско усклађени у својим обрасцима експресије. Транскрипциони фактор MYB8 и структурни гени PAL1, PAL2, C4H и 4CL узводно од овог пута показали су рану иницијацију транскрипције. Ацилтрансферазе које играју улогу у коначном склапању феноламида, као што су AT1, DH29 и CV86, показују продужени образац повећања експресије (Слика S4). Горенаведена запажања указују на то да су рана иницијација специјализације транскриптома и касније побољшање метаболомичке специјализације спрегнути начин рада, што може бити последица синхроног регулаторног система који покреће снажан одбрамбени одговор.
Реконфигурација у сигнализацији биљних хормона делује као регулаторни слој који интегрише информације биљоједа како би репрограмирао физиологију биљака. Након симулације биљоједа, измерили смо кумулативну динамику кључних категорија биљних хормона и визуализовали временску коекспресију између њих [Пирсонов коефицијент корелације (PCC) > 0,4] (Слика 3А). Као што се и очекивало, биљни хормони повезани са биосинтезом су повезани унутар мреже коекспресије биљних хормона. Поред тога, метаболичка специфичност (Si индекс) је мапирана на ову мрежу како би се истакли биљни хормони индуковани различитим третманима. Нацртана су два главна подручја специфичног одговора биљоједа: једно је у JA кластеру, где JA (његов биолошки активни облик JA-Ile) и други JA деривати показују највиши Si резултат; друго је етилен (ET). Гиберелин је показао само умерено повећање специфичности биљоједа, док су други биљни хормони, као што су цитокинина, ауксина и апсцисинске киселине, имали ниску индукциону специфичност за биљоједе. У поређењу са коришћењем само W + W, појачавање вршне вредности JA деривата путем примене OS (W + OS) може се у основи трансформисати у јак специфичан индикатор JA. Неочекивано, познато је да OSM и OSS1 са различитим садржајем елиситора изазивају сличну акумулацију JA и JA-Ile. За разлику од OSS1, OSM је специфично и снажно индукован OSM-овима, док OSS1 не појачава одговор базалних рана (Слика 3Б).
(А) Анализа мреже коекспресије заснована на PCC прорачуну симулације кинетике акумулације биљних хормона индукованих биљним биљкама. Чвор представља један биљни хормон, а величина чвора представља Si индекс специфичан за биљни хормон између третмана. (Б) Акумулација JA, JA-Ile и ET у листовима изазвана различитим третманима назначеним различитим бојама: кајсија, W + OSM; плава, W + OSSl; црна, W + W; сива, C (контрола). Звездице означавају значајне разлике између третмана и контроле (двосмерна ANOVA праћена Tukey HSD post hoc вишеструким поређењем, *** P <0,001). Анализа теорије информација (C)697 MS/MS (датотека података S1) у биосинтези JA и спектру оштећене перцепције (irAOC и irCOI1) и (D)585 MS/MS (датотека података S1) у ETR1 са оштећеним ET сигналом. Два симулирана третмана биљним биљкама покренула су линије биљака и контролне биљке са празним возилом (EV). Звездице означавају значајне разлике између третмана W+OS и неоштећене контроле (двосмерна ANOVA праћена Tukey HSD post hoc вишеструким поређењем, *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001). (Е) Расути графикони расутог отпора специјализацији. Боје представљају различите генетски модификоване сојеве; симболи представљају различите методе третмана: троугао, W + OSS1; правоугаоник, W + OSM; круг C
Затим, користимо генетски модификовани сој атенуираних Nepenthes-а (irCOI1 и sETR1) у кључним корацима биосинтезе JA и ET (irAOC и irACO) и перцепције (irCOI1 и sETR1) да бисмо анализирали метаболизам ова два биљна хормона код биљоједа. Релативни допринос репрограмирања. У складу са претходним експериментима, потврдили смо индукцију биљоједних-OS код биљки са празним носачима (EV) (слика 3, од C до D) и укупно смањење Hj индекса изазвано OSM-ом, док се δj индекс повећао. Одговор је израженији од одговора изазваног OSS1. Дволинијски графикон који користи Hj и δj као координате приказује специфичну дерегулацију (слика 3E). Најочигледнији тренд је да су код сојева којима недостаје JA сигнал, разноликост метаболома и промене специјализације изазване биљоједима готово потпуно елиминисане (слика 3C). Насупрот томе, тиха перцепција ЕТ код sETR1 биљака, иако је укупни ефекат на промене у метаболизму биљоједа много нижи од ефекта JA сигнализације, смањује разлику у Hj и δj индексима између OSM и OSS1 ексцитација (слика 3D и слика S5). Ово указује да поред основне функције трансдукције JA сигнала, трансдукција ЕТ сигнала служи и као фино подешавање метаболичког одговора биљоједа специфичног за врсту. У складу са овом функцијом финог подешавања, није било промене у укупној индуцибилности метаболома код sETR1 биљака. С друге стране, у поређењу са sETR1 биљкама, irACO биљке су индуковале сличне укупне амплитуде метаболичких промена изазваних биљоједима, али су показале значајно различите Hj и δj резултате између OSM и OSS1 изазова (слика S5).
Да бисмо идентификовали специјализоване метаболите који имају важан допринос специфичном одговору биљоједа за врсту и фино подесили њихову производњу путем ЕТ сигнала, користили смо претходно развијену структурну MS/MS методу. Ова метода се ослања на методу би-кластеровања како би се поново закључила метаболичка фамилија из MS/MS фрагмената [нормализовани скаларни производ (NDP)] и резултата сличности на основу неутралног губитка (NL). MS/MS скуп података конструисан анализом ЕТ трансгених линија произвео је 585 MS/MS (датотека података S1), што је разрешено њиховим груписањем у седам главних MS/MS модула (M) (Слика 4А). Неки од ових модула су густо упаковани претходно окарактерисаним посебним метаболитима: на пример, M1, M2, M3, M4 и M7 су богати различитим фенолним дериватима (M1), флавоноидним гликозидима (M2), ацил шећерима (M3 и M4) и 17-HGL-DTG (M7). Поред тога, израчунавају се специфичне метаболичке информације (Si индекс) појединачног метаболита у сваком модулу, а његова Si дистрибуција се може интуитивно видети. Укратко, MS/MS спектри који показују високу биљоједску и генотипску специфичност карактеришу се високим вредностима Si, а статистика куртозе указује на дистрибуцију крзна на десном углу репа. Једна таква дистрибуција мршавог колоида је откривена у M1, у којем је фенол амид показао највећу фракцију Si (Слика 4Б). Претходно поменути биљоједни индуцибилни 17-HGL-DTG у M7 показао је умерен Si резултат, што указује на умерен степен диференцијалне регулације између два типа OS. Насупрот томе, већина конститутивно произведених специјализованих метаболита, као што су рутин, CGA и ацил шећери, су међу најнижим Si резултатима. Да би се боље истражила структурна сложеност и дистрибуција Si између посебних метаболита, конструисана је молекуларна мрежа за сваки модул (Слика 4Б). Важно предвиђање OD теорије (сумирано на слици 1Б) је да би реорганизација посебних метаболита након биљоједства требало да доведе до једносмерних промена у метаболитима са високом одбрамбеном вредношћу, посебно повећањем њихове специфичности (за разлику од случајне дистрибуције) Режим) Одбрамбени метаболит предвиђен MT теоријом. Већина фенолних деривата акумулираних у M1 функционално је повезана са падом учинка инсеката (32). Када смо упоредили вредности Si у M1 метаболитима између индукованих листова и конститутивних листова контролних EV биљака након 24 сата, приметили смо да метаболичка специфичност многих метаболита након биљоједних инсеката има значајан тренд раста (слика 4Ц). Специфично повећање вредности Si је откривено само код одбрамбених феноламида, али није откривено повећање вредности Si код других фенола и непознатих метаболитима који коегзистирају у овом модулу. Ово је специјализовани модел, који је повезан са OD теоријом. Главна предвиђања метаболичких промена изазваних биљоједима су конзистентна. Да бисмо тестирали да ли је ова посебност феноламидног спектра индукована ЕТ-ом специфичним за ОС, направили смо графикон метаболитног Si индекса и изазвали диференцијалну вредност експресије између OSM и OSS1 у генотиповима EV и sETR1 (Слика 4D). Код sETR1, разлика изазвана фенамидом између OSM и OSS1 била је значајно смањена. Метода би-кластеровања је такође примењена на MS/MS податке прикупљене у сојевима са недовољном JA да би се закључили главни MS/MS модули повезани са JA-регулисаном метаболичком специјализацијом (Слика S6).
(А) Резултати груписања 585 MS/MS на основу заједничког фрагмента (сличност НДП) и заједничког неутралног губитка (сличност НЛ) резултирају модулом (М) који је конзистентно са познатом породицом једињења, или непознатим или слабо метаболизованим саставом метаболита. Поред сваког модула, приказана је специфична (Si) дистрибуција метаболита (МС/МС). (Б) Модуларна молекуларна мрежа: Чворови представљају МС/МС и ивице, НДП (црвена) и НЛ (плава) МС/МС резултате (гранична вредност, > 0,6). Градирани индекс специфичности метаболита (Si) обојен на основу модула (лево) и мапиран на молекуларну мрежу (десно). (Ц) Модул М1 EV биљке у конститутивном (контрола) и индукованом стању (симулирани биљојед) након 24 сата: дијаграм молекуларне мреже (вредност Si је величина чвора, одбрамбени феноламид је истакнут плавом бојом). (D) Дијаграм молекуларне мреже M1 спектралне линије sETR1 са оштећеном перцепцијом EV и ET: фенолно једињење представљено зеленим кружним чвором и значајна разлика (P вредност) између третмана W + OSM и W + OSS1 као величина чвора. CP, N-кафеоил-тирозин; CS, N-кафеоил-спермидин; FP, естар N-ферулинске киселине-уринска киселина; FS, N-ферулил-спермидин; CoP, N', N “-кумаролил-тирозин; DCS, N', N”-дикафеоил-спермидин; CFS, N', N”-кафеоил, ферулоил-спермидин; Lycium barbarum у вучјој бобици Son; Nick. O-AS, O-ацил шећер.
Даље смо проширили анализу са једног атенуираног генотипа Nepenthes на природне популације, где су раније описане јаке интраспецифичне промене у нивоима биљоједа JA и специфичним нивоима метаболита у природним популацијама (26). Користите овај скуп података да покријете 43 гермплазме. Ове гермплазме се састоје од 123 врсте биљака из N. pallens. Ове биљке су узете из семена сакупљених у различитим аутохтоним стаништима у Јути, Невади, Аризони и Калифорнији (Слика S7), израчунали смо разноликост метаболома (овде названу ниво популације) β разноликост) и специјализацију узроковану OSM. У складу са претходним студијама, посматрали смо широк спектар метаболичких промена дуж Hj и δj оса, што указује да гермплазме имају значајне разлике у пластичности својих метаболичких одговора на биљоједе (Слика S7). Ова организација подсећа на претходна запажања о динамичком опсегу промена JA изазваних биљоједима и одржала је веома високу вредност у једној популацији (26, 36). Коришћењем JA и JA-Ile за тестирање укупне корелације нивоа између Hj и δj, открили смо да постоји значајна позитивна корелација између JA и индекса разноликости и специјализације метаболома β (слика S7). Ово сугерише да би хетерогеност индукована биљоједима у индукцији JA, откривена на нивоу популације, могла бити последица кључних метаболичких полиморфизама изазваних селекцијом инсеката биљоједа.
Претходне студије су показале да се врсте дувана значајно разликују по типу и релативној зависности од индуковане и конститутивне метаболичке одбране. Верује се да су ове промене у преносу сигнала против биљоједа и одбрамбеним способностима регулисане притиском популације инсеката, животним циклусом биљке и трошковима производње одбране у ниши где дата врста расте. Проучавали смо конзистентност ремоделирања метаболома листа изазваног од стране биљоједа шест врста Nicotiana пореклом из Северне и Јужне Америке. Ове врсте су блиско повезане са Nepenthes North America, наиме Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. atenuated grass, Nicotiana tabacum, линеарни дуван, дуван (Nicotiana spegazzinii) и дуван од листа дувана (Nicotiana obtusifolia) (слика 5А) (37). Шест ових врста, укључујући добро окарактерисану врсту N. please, су једногодишње биљке из кладе петунија, а obtusifolia N. су вишегодишње биљке из сестринске кладе Trigonophyllae (38). Након тога, индукција W + W, W + OSM и W + OSS1 је извршена на ових седам врста како би се проучило метаболичко преуређење исхране инсеката на нивоу врсте.
(А) Филогенетско стабло „bootstrap“ засновано на максималној вероватноћи [за синтезу нуклеарног глутамина (38)] и географској дистрибуцији седам блиско сродних врста Nicotiana (различите боје) (37). (Б) Диаграм расејања специјализоване разноликости за метаболичке профиле седам врста Nicotiana (939 MS/MS; датотека са подацима S1). На нивоу врсте, разноликост метаболома је негативно корелирана са степеном специјализације. Анализа корелације на нивоу врсте између метаболичке разноликости и специјализације и акумулације JA приказана је на слици 2. S9. Боја, различити типови; троугао, W + OSS1; правоугаоник, W + OSM; (Ц) Динамика JA и JA-Ile код Nicotiana је рангирана према амплитуди побуђивања OS (двосмерна ANOVA и Tukey HSD након вишеструког поређења, * P <0,05, ** P <0,01 и * ** За поређење W + OS и W + W, P <0,001). Кутијасти графикон (D) разноликости и (E) специјализације сваке врсте након симулације биљоједа и метил JA (MeJA). Звездица означава значајну разлику између W + OS и W + W или ланолина плус W (Lan + W) или Lan плус MeJA (Lan + MeJa) и Lan контроле (двосмерна анализа варијансе, праћена Тукијевим HSD пост хок вишеструким поређењем, *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001).
Користећи метод двоструких кластера, идентификовали смо 9 модула од 939 MS/MS (датотека података S1). Састав MS/MS реконфигурисаних различитим третманима значајно варира међу различитим модулима између врста (Слика S8). Визуелизација Hj (овде названа γ-разноврсност на нивоу врсте) и δj открива да се различите врсте агрегирају у веома различите групе у метаболичком простору, где је подела на нивоу врсте обично израженија од ексцитације. Са изузетком N. linear и N. obliquus, оне показују широк динамички опсег индукционих ефеката (Слика 5B). Насупрот томе, врсте као што су N. purpurea и N. obtusifolia имају мање очигледан метаболички одговор на третман, али је метаболом разноврснији. Дистрибуција индукованог метаболичког одговора специфична за врсту резултирала је значајном негативном корелацијом између специјализације и гама разноврсности (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Промене у нивоима ЈА изазване ОС-ом позитивно су корелиране са специјализацијом метаболома и негативно су корелиране са метаболичком гама разноликошћу коју показује свака врста (слика 5Б и слика С9). Вреди напоменути да су врсте колоквијално називане врстама „одговора на сигнал“ на слици 5Ц, као што су Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute и Nepenthes attenuated, изазвале значајне знаке након 30 минута. Недавне епидемије ЈА и ЈА-Иле специфичне за ОС, док друге бактерије назване „неодговорне на сигнал“, као што су Nepenthes mills, Nepenthes powdery и N. obtusifolia, показују само индукцију ЈА-Иле на ивици без икакве специфичности за ОС (слика 5Ц). На метаболичком нивоу, као што је горе поменуто, за атенуиране Nepenthes, супстанце које реагују на сигнал показале су специфичност за ОС и значајно повећале δj, док су смањиле Hj. Овај ефекат прајминга специфичан за ОС није откривен код врста класификованих као врсте које не реагују на сигнал (слика 5, Д и Е). Метаболити специфични за ОС чешће се деле између врста које реагују на сигнале, а ови сигнални кластери се групишу са врстама са слабијим сигналним одговорима, док врсте са слабијим сигналним одговорима показују мању међузависност (Слика S8). Овај резултат указује на то да су индукција ЈА специфична за ОС и реконфигурација низводног метаболома специфична за ОС повезане на нивоу врсте.
Затим смо користили ланолинску пасту која садржи метил JA (MeJA) за третирање биљака како бисмо истражили да ли су ови начини спрезања ограничени доступношћу JA примењеног егзогеним JA, који ће бити у цитоплазми биљака. Брза деестерификација је JA. Пронашли смо исти тренд постепене промене од врста које реагују на сигнале до врста које не реагују на сигнале, узрокован континуираним снабдевањем JA (Слика 5, Д и Е). Укратко, третман MeJA је снажно репрограмирао метаболоме линеарних нематода, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens и N. mikimotoi, што је резултирало значајним повећањем δj и смањењем Hj. Само N. purpurea је показала повећање δj, али не и Hj. N. obtusifolia, за коју је претходно показано да акумулира изузетно ниске нивое JA, такође слабо реагује на третман MeJA у смислу реконфигурације метаболома. Ови резултати указују на то да је производња JA или пренос сигнала физиолошки ограничена код врста које не реагују на сигнале. Да бисмо тестирали ову хипотезу, проучавали смо четири врсте (N. pallens, N. mills, N. pink и N. microphylla) индуковане W + W, W + OSM и W + OSS1 транскриптомом (39). У складу са обрасцем ремоделирања метаболома, врсте су добро раздвојене у транскриптомском простору, међу којима је N. attenuated показао највећи OS-индуковани RDPI, док је N. gracilis имао најнижи (Слика 6А). Међутим, утврђено је да је транскриптомска разноликост индукована од стране N. oblonga била најнижа међу четири врсте, супротно највећој метабономској разноликости N. oblonga која је претходно показана код седам врста. Претходне студије су показале да скуп гена повезаних са раним одбрамбеним сигналима, укључујући JA сигнале, објашњава специфичност раних одбрамбених одговора изазваних елиситорима повезаним са биљоједима код врста Nicotiana (39). Поређење JA сигналних путева између ове четири врсте открило је занимљив образац (Слика 6Б). Већина гена у овом путу, као што су AOC, OPR3, ACX и COI1, показала је релативно високе нивое индукције код ове четири врсте. Међутим, кључни ген, JAR4, претвара JA у његов биолошки активни облик акумулираних транскрипата JA-Ile, а његов ниво транскрипције је веома низак, посебно код N. mills, Nepenthes pieris и N. microphylla. Поред тога, само транскрипт другог гена AOS није детектован код N. bifidum. Ове промене у експресији гена могу бити одговорне за екстремне фенотипове изазване ниском продукцијом JA код сигнално анергичних врста и индукцијом N. gracilis.
(А) Анализа теорије информација о репрограмирању раних транскрипционих одговора четири блиско сродне врсте дувана узорковане 30 минута након индукције биљоједа. RDPI се израчунава поређењем листова индукованих биљоједом OS са контролном групом ране. Боје означавају различите врсте, а симболи различите методе третмана. (Б) Анализа експресије гена у JA сигналним путевима код четири врсте. Поједностављени JA пут је приказан поред оквирног дијаграма. Различите боје означавају различите методе обраде. Звездица означава да постоји значајна разлика између W + OS третмана и W + W контроле (за Студентов t-тест за парне разлике, *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001). OPDA, 12-оксофитодиенска киселина; OPC-8: 0,3-оксо-2(2′(Z)-пентенил)-циклопентан-1-октанска киселина.
У последњем делу, проучавали смо како специфично преуређење метаболома инсеката различитих биљних врста може бити отпорно на биљоједе. Претходна истраживања су се фокусирала на род Nicotiana. Њихова отпорност на Ms и ларве се значајно разликује (40). Овде смо проучавали везу између овог модела и њихове метаболичке пластичности. Користећи горе наведене четири врсте дувана и тестирајући корелацију између разноликости и специјализације метаболома изазваног биљоједима и отпорности биљака на Ms и Sl, открили смо да су отпорност, разноликост и специјализација на генерализовани Sl све позитивно корелиране, док је корелација између отпорности на експертске даме и специјализације слаба, а корелација са разноликошћу није значајна (Слика S10). Што се тиче отпорности на S1, и ослабљени N. chinensis и N. gracilis, за које је претходно показано да показују и нивое трансдукције JA сигнала и пластичност метаболома, имали су значајно различите одговоре на индукцију биљоједа, а такође су показали сличну високу отпорност. Пол.
У протеклих шездесет година, теорија одбране биљака пружила је теоријски оквир, на основу којег су истраживачи предвидели значајан број еволуције и функција специјализованих метаболита биљака. Већина ових теорија не прати нормалну процедуру јаких закључака (41). Оне предлажу кључна предвиђања (3) на истом нивоу анализе. Када тестирање кључних предвиђања омогући анализу специфичних теорија, то ће учинити да се област креће напред. Бити подржано, али одбацити друге (42). Уместо тога, нова теорија даје предвиђања на различитим нивоима анализе и додаје нови слој дескриптивних разматрања (42). Међутим, две теорије предложене на функционалном нивоу, МТ и ОД, могу се лако објаснити као важна предвиђања специјализованих метаболичких промена изазваних биљоједима: ОД теорија верује да су промене у специјализованом метаболичком „простору“ веома усмерене. МТ теорија верује да ће ове промене бити неусмерене и насумично лоциране у метаболичком простору и да имају тенденцију да имају метаболите високе одбрамбене вредности. Претходна испитивања ОД и МТ предвиђања тестирана су коришћењем уског скупа априори „одбрамбених“ једињења. Ови тестови усмерени на метаболит онемогућавају анализу обима и путање реконфигурације метаболома током биљоједства и не дозвољавају тестирање унутар конзистентног статистичког оквира које захтева кључна предвиђања која се могу посматрати као целина. Квантификујте промене у биљном метаболому. Овде смо користили иновативну технологију у метаболомици засновану на рачунарској мас-спектроскопији (МС) и извршили деконволуциону МС анализу у општој валути дескриптора теорије информација како бисмо тестирали разлику између ова два предложена на глобалном нивоу метаболомике. Кључно предвиђање ове теорије. Теорија информација је примењена у многим областима, посебно у контексту истраживања биодиверзитета и протока хранљивих материја (43). Међутим, колико знамо, ово је прва примена која се користи за описивање метаболичког информационог простора биљака и решавање еколошких проблема везаних за привремене метаболичке промене као одговор на сигнале из околине. Конкретно, способност ове методе лежи у њеној способности да упореди обрасце унутар и између биљних врста како би се испитало како су биљоједи еволуирали од различитих врста до међуврсних макроеволуционих образаца на различитим нивоима еволуције. Метаболизам.
Анализа главних компоненти (PCA) претвара мултиваријантни скуп података у простор за редукцију димензионалности тако да се може објаснити главни тренд података, па се обично користи као истраживачка техника за анализу скупа података, као што је деконволуциони метаболом. Међутим, редукција димензионалности ће изгубити део информативног садржаја у скупу података, а PCA не може да пружи квантитативне информације о карактеристикама које су посебно релевантне за еколошку теорију, као што су: како биљоједи реконфигуришу разноликост у специјализованим областима (на пример, богатство, дистрибуција) и бројност) метаболити? Који метаболити су предиктори индукованог стања датог биљоједа? Са становишта специфичности, разноликости и индуцибилности, информативни садржај профила метаболита специфичног за лист се разлаже и утврђено је да једење биљоједа може активирати специфични метаболизам. Неочекивано, приметили смо да, као што је описано у имплементираним индикаторима теорије информација, резултујућа метаболичка ситуација има велико преклапање након напада два биљоједа (ноћно храњеног генералиста Сл) и стручњака за Solanaceae гђу. Иако су њихово понашање у исхрани и концентрација значајно различити. Иницијатор конјугата масних киселина и аминокиселина (FAC) у OS (31). Коришћењем биљоједског OS за лечење стандардизованих убодних рана, симулирани третман биљоједа је такође показао сличан тренд. Овај стандардизовани поступак за симулацију одговора биљака на нападе биљоједа елиминише збуњујуће факторе изазване променама у понашању биљоједа у исхрани, што доводи до различитих степена оштећења у различитим временима (34). FAC, за који се зна да је главни узрок OSM-а, смањује JAS и друге одговоре биљних хормона у OSS1, док OSS1 смањује стотине пута (31). Међутим, OSS1 је изазвао сличне нивое акумулације JA у поређењу са OSM. Претходно је показано да је одговор JA код атенуираних Nepenthes-а веома осетљив на OSM, где FAC може да одржи своју активност чак и ако је разблажен 1:1000 са водом (44). Стога, у поређењу са OSM, иако је FAC у OSS1 веома низак, довољан је да изазове довољну епидемију JA. Претходне студије су показале да се протеини слични порину (45) и олигосахариди (46) могу користити као молекуларни трагови за покретање одбрамбених одговора биљака у OSS1. Међутим, још увек није јасно да ли су ови елиситори у OSS1 одговорни за акумулацију JA примећену у тренутној студији.
Иако постоји мало студија које описују различите метаболичке отиске прстију изазване применом различитих биљоједа или егзогених ЈА или СА (салицилна киселина) (47), нико није пореметио специфичне пертурбације биљоједа у мрежи биљне траве и њене ефекте на специфичне личне податке. Укупан утицај метаболизма се систематски проучава. Ова анализа је додатно потврдила да веза унутрашње хормонске мреже са другим биљним хормонима, осим ЈА, обликује специфичност метаболичке реорганизације коју изазивају биљоједи. Конкретно, открили смо да је ЕТ изазван ОСМ-ом био значајно већи од оног изазваног ОСС1. Овај начин рада је у складу са већим садржајем ФАЦ у ОСМ-у, што је неопходан и довољан услов за покретање ЕТ експлозије (48). У контексту интеракције између биљака и биљоједа, сигнална функција ЕТ на динамику метаболита специфичних за биљку је и даље спорадична и циља само једну групу једињења. Поред тога, већина студија је користила егзогену примену ЕТ или његових прекурсора или различитих инхибитора за проучавање регулације ЕТ-а, међу којима ће ове егзогене хемијске примене произвести многе неспецифичне нежељене ефекте. Колико нам је познато, ова студија представља прво систематско испитивање великих размера улоге ЕТ-а у његовој употреби за производњу и перцепцију оштећених трансгених биљака ради координације динамике биљног метаболома. Индукција ЕТ-а специфична за биљоједе може на крају модулирати одговор метаболома. Најзначајнија је трансгена манипулација генима биосинтезе (ACO) и перцепције (ETR1) ЕТ-а која је открила de novo акумулацију феноламида специфичну за биљоједе. Претходно је показано да ЕТ може фино подесити акумулацију никотина индуковану JA регулисањем путресцин N-метилтрансферазе (49). Међутим, са механичке тачке гледишта, није јасно како ЕТ фино подешава индукцију фенамида. Поред функције преноса сигнала ЕТ-а, метаболички ток се такође може усмерити на S-аденозил-1-метионин да би се регулисало улагање у полиаминофенол амиде. S-аденозил-1-метионин је ЕТ и уобичајени интермедијер биосинтетског пута полиамина. Механизам којим ЕТ сигнал регулише ниво феноламида захтева даља истраживања.
Дуго времена, због великог броја посебних метаболита непознате структуре, интензивна пажња посвећена специфичним метаболичким категоријама није била у могућности да стриктно процени временске промене метаболичке разноликости након биолошких интеракција. Тренутно, на основу анализе теорије информација, главни резултат MS/MS спектралне аквизиције засноване на непристрасним метаболитима је да биљоједи који једу или симулирају биљоједе настављају да смањују укупну метаболичку разноликост метаболома листа, док истовремено повећавају степен његове специјализације. Ово привремено повећање специфичности метаболома изазвано биљоједима повезано је са синергистичким повећањем специфичности транскриптома. Карактеристика која највише доприноси овој већој специјализацији метаболома (имајући већу вредност Si) је посебан метаболит са претходно окарактерисаном биљоједском функцијом. Овај модел је у складу са предвиђањем теорије OD, али предвиђање MT повезано са случајношћу репрограмирања метаболома није конзистентно. Међутим, ови подаци су такође у складу са предвиђањем мешовитог модела (најбољи MT; Слика 1Б), јер други некарактерисани метаболити са непознатим одбрамбеним функцијама и даље могу пратити случајну расподелу Si.
Значајан образац који је додатно ухваћен овим истраживањем јесте да су од нивоа микроеволуције (појединачна биљка и популација дувана) до веће еволуционе скале (блиско сродне врсте дувана), различити нивои еволуционе организације у „најбољој одбрани“. Постоје значајне разлике у способностима биљоједа. Мур и др. (20) и Кеслер и Калске (1) су независно предложили да се три функционална нивоа биодиверзитета које је првобитно разликовао Витакер (50) претворе у конститутивне и индуковане временске промене хемијске разноврсности; ни ови аутори нису сумирали. Поступци за прикупљање података о метаболому великих размера такође не наводе како израчунати метаболичку разноврсност из ових података. У овој студији, мање измене Витакерове функционалне класификације ће разматрати α-метаболичку разноврсност као разноврсност MS/MS спектара у датој биљци, а β-метаболичку разноврсност као основни интраспецифични метаболизам групе популација, а γ-метаболичка разноврсност ће бити проширење анализе сличних врста.
JA сигнал је неопходан за широк спектар метаболичких одговора биљоједа. Међутим, недостаје ригорозно квантитативно тестирање доприноса интраспецифичне регулације биосинтезе JA разноврсности метаболома, а да ли је JA сигнал опште место за метаболичку диверзификацију изазвану стресом на вишој макроеволуционој скали још увек није јасно. Приметили смо да биљоједна природа биљоједа Nepenthes индукује специјализацију метаболома и да је варијација специјализације метаболома унутар популације врста Nicotiana и међу блиско сродним врстама Nicotiana систематски позитивно корелирана са JA сигнализацијом. Поред тога, када је JA сигнал оштећен, метаболичка специфичност индукована једним генотипом биљоједа биће поништена (Слика 3, C и E). Пошто су промене метаболичког спектра природно атенуираних популација Nepenthes углавном квантитативне, промене у метаболичкој β разноврсности и специфичности у овој анализи могу бити у великој мери узроковане јаком ексцитацијом категорија једињења богатих метаболитима. Ове класе једињења доминирају делом профила метаболома и доводе до позитивне корелације са JA сигналима.
Пошто су биохемијски механизми врста дувана које су му блиско повезане веома различити, метаболити су специфично идентификовани у квалитативном аспекту, тако да је то аналитичкије. Обрада снимљеног метаболичког профила од стране теорије информација открива да биљоједска индукција погоршава компромис између метаболичке гама разноликости и специјализације. JA сигнал игра централну улогу у овом компромису. Повећање специјализације метаболома је у складу са главним предвиђањем оптичке густине (OD) и позитивно је корелирано са JA сигналом, док је JA сигнал негативно корелиран са метаболичком гама разноликошћу. Ови модели указују да је OD капацитет биљака углавном одређен пластичношћу JA, било на микроеволуционој скали или на већој еволуционој скали. Експерименти примене егзогене JA који заобилазе дефекте биосинтезе JA даље откривају да се блиско повезане врсте дувана могу разликовати у врсте које реагују на сигнал и врсте које не реагују на сигнал, баш као и њихов начин JA и пластичност метаболома индукована биљоједима. Врсте које не реагују на сигнал не могу да реагују због своје немогућности да производе ендогену JA и стога су подложне физиолошким ограничењима. Ово може бити узроковано мутацијама у неким кључним генима у JA сигналном путу (AOS и JAR4 код N. crescens). Овај резултат указује на то да ови међуврсни макроеволуциони обрасци могу бити углавном вођени променама у перцепцији и одговору унутрашњих хормона.
Поред интеракције између биљака и биљоједа, истраживање метаболичке разноликости повезано је са свим важним теоријским напретком у истраживању биолошке адаптације на животну средину и еволуције сложених фенотипских особина. Са повећањем количине података прикупљених модерним MS инструментима, тестирање хипотеза о метаболичкој разноликости сада може превазићи разлике у индивидуалним/категоријским метаболитима и извршити глобалну анализу како би се открили неочекивани обрасци. У процесу анализе великих размера, важна метафора је идеја о осмишљавању значајних мапа које се могу користити за истраживање података. Стога, важан резултат тренутне комбинације непристрасне MS/MS метаболомике и теорије информација јесте то што пружа једноставну метрику која се може користити за конструисање мапа за прегледање метаболичке разноликости на различитим таксономским скалама. То је основни захтев ове методе. Проучавање микро/макро еволуције и екологије заједнице.
На макроеволуционом нивоу, суштина теорије коеволуције биљака и инсеката Ерлиха и Равена (51) јесте предвиђање да је варијација међуврсне метаболичке разноликости узрок диверзификације биљних линија. Међутим, у педесет година од објављивања овог капиталног рада, ова хипотеза је ретко тестирана (52). То је углавном због филогенетских карактеристика упоредивих метаболичких карактеристика код биљних линија на великим удаљеностима. Реткост се може користити за учвршћивање метода анализе циља. Тренутни ток рада MS/MS, обрађен теоријом информација, квантификује структурну сличност непознатих метаболита MS/MS (без претходне селекције метаболита) и претвара ове MS/MS у скуп MS/MS, тако да се у професионалном метаболизму ови макроеволуциони модели упоређују у скали класификације. Једноставни статистички индикатори. Процес је сличан филогенетској анализи, која може користити поравнање секвенци да квантификује стопу диверзификације или еволуцију карактера без претходног предвиђања.
На биохемијском нивоу, хипотеза скрининга Фирна и Џоунса (53) показује да се метаболичка разноликост одржава на различитим нивоима како би се обезбедиле сировине за испољавање биолошких активности претходно неповезаних или супституисаних метаболита. Методе теорије информација пружају оквир у коме се ови еволутивни прелази специфични за метаболите, који се јављају током специјализације метаболита, могу квантификовати као део предложеног еволутивног процеса скрининга: биолошки активна адаптација од ниске специфичности до високе специфичности. Инхибирани метаболити датог окружења.
Све у свему, у раним данима молекуларне биологије, развијене су важне теорије одбране биљака, а дедуктивне методе засноване на хипотезама се широко сматрају јединим средством научног напретка. То је углавном због техничких ограничења мерења целог метаболома. Иако су методе засноване на хипотезама посебно корисне у избору других узрочних механизама, њихова способност да унапреде наше разумевање биохемијских мрежа је ограниченија од рачунарских метода које су тренутно доступне у савременој науци која интензивно користи податке. Стога, теорије које се не могу предвидети далеко превазилазе обим доступних података, тако да се хипотетичка формула/тест циклус напретка у области истраживања не може укинути (4). Предвиђамо да рачунарски ток рада метаболомике представљен овде може поново пробудити интересовање за недавна (како) и коначна (зашто) питања метаболичке разноликости и допринети новој ери теоретски вођене науке о подацима. Ера је поново испитала важне теорије које су инспирисале претходне генерације.
Директно храњење биљоједа врши се узгојем ларве другог инстара или Sl ларве на једном листу бледо обојене биљке бокале једне биљке која цвета руже, са 10 биљних реплика по биљци. Ларве инсеката су стегнуте стезаљкама, а преостало ткиво листа је сакупљено 24 и 72 сата након инфекције и брзо замрзнуто, а метаболити су екстраховани.
Симулирајте третман биљоједа на високо синхронизован начин. Метода је да се користе точкови са тканином за пробушење три реда трња са сваке стране средњег ребра три потпуно развијена листа биљке током фазе раста тканине, и одмах нанесе разблажени Ms у односу 1:5. Или користите рукавице да убаците S1 OS у рану од убода. Уберите и обрадите лист као што је горе описано. Користите претходно описану методу за екстракцију примарних метаболита и биљних хормона (54).
За егзогене примене ЈА, три петељке листова сваке од шест биљака ружа које цветају сваке врсте третирају се са 20 μl ланолинске пасте која садржи 150 μg MeJA (Lan + MeJA) и 20 μl ланолина плус третман рана (Lan + W), или се користи 20 μl чистог ланолина као контрола. Листови су убрани 72 сата након третмана, брзо замрзнути у течном азоту и чувани на -80°C до употребе.
Четири трансгене линије JA и ET, наиме irAOC (36), irCOI1 (55), irACO и sETR1 (48), идентификоване су у нашој истраживачкој групи. irAOC је показао снажно смањење нивоа JA и JA-Ile, док irCOI1 није био осетљив на JA. У поређењу са EV, акумулација JA-Ile се повећала. Слично томе, irACO ће смањити производњу ET, а у поређењу са EV, sETR1, који је неосетљив на ET, повећаће производњу ET.
За неинвазивно мерење ЕТ користи се фотоакустични ласерски спектрометар (Sensor Sense ETD-300 ЕТ сензор у реалном времену). Одмах након третмана, половина листова је исечена и пребачена у затворену стаклену бочицу од 4 мл, а простор изнад је остављен да се акумулира у року од 5 сати. Током мерења, свака бочица је испрана струјом чистог ваздуха од 2 литра/сат током 8 минута, који је претходно прошао кроз катализатор који је обезбедио Sensor Sense ради уклањања CO2 и воде.
Подаци микрочипа су првобитно објављени у (35) и сачувани у Свеобухватној бази података о експресији гена Националног центра за биотехнолошке информације (NCBI) (приступни број GSE30287). Подаци који одговарају листовима изазваним третманом W + OSM и неоштећеној контроли су издвојени за ову студију. Необрађени интензитет је log2. Пре статистичке анализе, основна линија је конвертована и нормализована на свој 75. перцентил коришћењем софтверског пакета R.
Оригинални подаци о секвенцирању РНК (RNA-seq) врста Nicotiana преузети су из NCBI архиве кратких читања (SRA), број пројекта је PRJNA301787, који су објавили Zhou и др. (39) и настављено је као што је описано у (56). Сирови подаци обрађени помоћу W + W, W + OSM и W + OSS1 који одговарају врстама Nicotiana одабрани су за анализу у овој студији и обрађени на следећи начин: Прво, сирова очитавања RNA-seq су конвертована у FASTQ формат. HISAT2 конвертује FASTQ у SAM, а SAMtools конвертује SAM датотеке у сортиране BAM датотеке. StringTie се користи за израчунавање експресије гена, а његова метода експресије је да постоје фрагменти на хиљаду база фрагмената на милион секвенцираних транскрипционих фрагмената.
Хроматографска колона Acclaim (150 mm x 2,1 mm; величина честица 2,2 μm) која се користи у анализи и заштитна колона 4 mm x 4 mm направљене су од истог материјала. Следећи бинарни градијент се користи у систему Dionex UltiMate 3000 ултра високо ефикасне течне хроматографије (UHPLC): 0 до 0,5 минута, изократски 90% A [дејонизована вода, 0,1% (v/v) ацетонитрила и 0,05% мравље киселине], 10% B (ацетонитрил и 0,05% мравље киселине); 0,5 до 23,5 минута, градијентна фаза је 10% A и 90% B, респективно; 23,5 до 25 минута, изократски 10% A и 90% B. Брзина протока је 400 μl/min. За све MS анализе, убризгајте елуент колоне у квадруполни и временски-пролетни (qTOF) анализатор опремљен извором електроспреја који ради у режиму позитивне јонизације (капиларни напон, 4500 V; капиларни излаз 130 V; температура сушења 200°C; проток ваздуха за сушење 10 литара/мин).
Извршите MS/MS анализу фрагмената (у даљем тексту MS/MS) који су ирелевантни или се не разликују од података да бисте добили структурне информације о укупном детектабилном метаболичком профилу. Концепт неселективне MS/MS методе заснива се на чињеници да квадрупол има веома велики прозор изолације масе [стога, сматрајте све сигнале односа масе и наелектрисања (m/z) фрагментима]. Из тог разлога, пошто инструмент Impact II није био у стању да створи CE нагиб, извршено је неколико независних анализа коришћењем повећаних вредности енергије дисоцијације (CE) изазване сударима. Укратко, прво анализирајте узорак помоћу UHPLC-електроспреј јонизације/qTOF-MS користећи режим једне масене спектрометрије (услови ниске фрагментације генерисани фрагментацијом у извору), скенирањем од m/z 50 до 1500 на фреквенцији понављања од 5 Hz. Користите азот као гас за сударе за MS/MS анализу и извршите независна мерења на следећа четири различита напона дисоцијације изазване сударима: 20, 30, 40 и 50 eV. Током процеса мерења, квадрупол има највећи прозор за изолацију масе, од m/z 50 до 1500. Када је експеримент m/z предњег тела и ширине изолације подешен на 200, опсег масе се аутоматски активира помоћу оперативног софтвера инструмента и 0 Da. Скенирајте за фрагменте масе као у режиму једне масе. Користите натријум формиат (50 ml изопропанола, 200 μl мравље киселине и 1 ml 1M воденог раствора NaOH) за калибрацију масе. Користећи Брукеров алгоритам за калибрацију високе прецизности, датотека са подацима се калибрише након покретања просечног спектра у датом временском периоду. Користите функцију извоза софтвера Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Бремен, Немачка) да бисте конвертовали сирове датотеке са подацима у NetCDF формат. Скуп података MS/MS је сачуван у отвореној бази података метаболомике MetaboLights (www.ebi.ac.uk) са приступним бројем MTBLS1471.
Склапање MS/MS може се реализовати кроз корелациону анализу између MS1 и MS/MS сигнала квалитета за ниску и високу енергију судара и новоимплементираних правила. R скрипта се користи за реализацију корелационе анализе расподеле прекурсора производа, а C# скрипта (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) се користи за имплементацију правила.
Да бисмо смањили лажно позитивне грешке изазване позадинском буком и лажном корелацијом изазваном детекцијом одређених m/z карактеристика у само неколико узорака, користимо функцију „попуњеног врха“ из R пакета XCMS (за корекцију позадинске буке). Требало би да се користи за замену интензитета „NA“ (недетектовани врх). Када се користи функција попуњеног врха, у скупу података и даље постоји много вредности интензитета „0“ које ће утицати на израчунавање корелације. Затим, упоређујемо резултате обраде података добијене када се користи функција попуњеног врха и када се функција попуњеног врха не користи, и израчунавамо вредност позадинске буке на основу просечне кориговане процењене вредности, а затим замењујемо ове вредности интензитета 0 израчунатом позадинском вредношћу. Такође смо разматрали само карактеристике чији је интензитет три пута већи од позадинске вредности и сматрали их „правим врховима“. За PCC израчунавања, разматрају се само m/z сигнали скупова података прекурсора узорка (MS1) и фрагмената са најмање осам правих врхова.
Ако је интензитет карактеристике квалитета прекурсора у целом узорку значајно корелиран са смањеним интензитетом исте карактеристике квалитета која је подвргнута ниској или високој енергији судара, и ако карактеристика није означена као изотопски врх помоћу CAMERA програма, она се може даље дефинисати. Затим, израчунавањем свих могућих парова прекурсор-производ у року од 3 с (процењени временски прозор задржавања за задржавање врха), врши се анализа корелације. Само када је вредност m/z нижа од вредности прекурсора и када се MS/MS фрагментација јави на истој локацији узорка у скупу података као и прекурсор из којег је изведена, сматра се фрагментом.
На основу ова два једноставна правила, искључујемо наведене фрагменте са m/z вредностима већим од m/z идентификованог прекурсора, и на основу положаја узорка где се прекурсор појављује и наведеног фрагмента. Такође је могуће одабрати карактеристике квалитета генерисане многим фрагментима у извору генерисаним у MS1 ​​моду као кандидате за прекурсоре, чиме се генеришу редундантна MS/MS једињења. Да бисмо смањили ову редундантност података, ако NDP сличност спектра прелази 0,6 и они припадају хроматограму „pcgroup“ означеном помоћу CAMERA, спојићемо их. Коначно, спајамо сва четири CE резултата повезана са прекурсором и фрагментима у коначни деконволуирани композитни спектар одабиром врха највишег интензитета међу свим кандидатским врховима са истом m/z вредношћу при различитим енергијама судара. Накнадни кораци обраде заснивају се на концепту композитног спектра и узимају у обзир различите CE услове потребне за максимизирање вероватноће фрагментације, јер се неки фрагменти могу детектовати само под одређеном енергијом судара.
RDPI (30) је коришћен за израчунавање индуцибилности метаболичког профила. Разноврсност метаболичког спектра (Hj индекс) је изведена из обиља MS/MS прекурсора коришћењем Шенонове ентропије MS/MS фреквентне расподеле користећи следећу једначину коју су описали Мартинез и др. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) где Pij одговара релативној фреквенцији i-тог MS/MS у j-том узорку (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Метаболичка специфичност (Si индекс) је дефинисана као идентитет експресије датог MS/MS у односу на фреквенцију између узорака који се разматрају. Специфичност MS/MS се израчунава као Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Користите следећу формулу за мерење метаболом-специфичног δj индекса сваког j узорка и просечне вредности MS/MS специфичности δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS спектри су поравнати у паровима, а сличност се израчунава на основу два резултата. Прво, користећи стандардни NDP (такође познат као метод косинусне корелације), користите следећу једначину да бисте проценили сличност сегмената између спектара NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 где S1 и S2 Одговарајуће, за спектар 1 и спектар 2, као и WS1, i и WS2, i представља тежину на основу интензитета пика, где је разлика i-тог заједничког пика између два спектра мања од 0,01 Da. Тежина се израчунава на следећи начин: W = [интензитет пика] m [квалитет] n, m = 0,5, n = 2, као што је предложио MassBank.
Имплементирана је друга метода бодовања, која је укључивала анализу заједничке НЛ између МС/МС. У ту сврху, користили смо 52 НЛ листе које се често срећу током процеса фрагментације МС заједно, и специфичнију НЛ (датотека података S1) која је претходно анотирана за МС/МС спектар секундарних метаболита ослабљене врсте Nepenthes (9, 26). Направити бинарни вектор од 1 и 0 за сваки МС/МС, што одговара тренутном и непостојећем неком НЛ, респективно. На основу сличности еуклидске удаљености, резултат сличности НЛ се израчунава за сваки пар бинарних НЛ вектора.
За извођење двоструког кластеровања, користили смо R пакет DiffCoEx, који је заснован на проширењу анализе пондерисане генске коекспресије (WGCNA). Користећи NDP и NL матрице бодовања MS/MS спектара, користили смо DiffCoEx за израчунавање упоредне корелационе матрице. Бинарно кластеровање се врши постављањем параметра „cutreeDynamic“ на method = „hybrid“, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T и minClusterSize = 10. R изворни код DiffCoEx-а је преузет из додатне датотеке 1 од стране Tesson et al. (57); Потребан R WGCNA софтверски пакет може се наћи на https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Да бисмо извршили MS/MS молекуларну мрежну анализу, израчунали смо упарену спектралну повезаност на основу типова сличности NDP и NL и користили Cytoscape софтвер за визуелизацију топологије мреже користећи органски распоред у апликацији за проширење алгоритма распореда CyFilescape yFiles.
Користите R верзију 3.0.1 за статистичку анализу података. Статистичка значајност је процењена коришћењем двофакторске анализе варијансе (ANOVA), након чега је уследио Тукијев пост-хок тест значајне разлике (HSD). Да би се анализирала разлика између третмана биљоједа и контроле, двострана дистрибуција две групе узорака са истом варијансом је анализирана коришћењем Студентовог t-теста.
За додатне материјале за овај чланак, погледајте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Ово је чланак отвореног приступа дистрибуиран под условима Creative Commons Attribution-Non-Commercial лиценце, која дозвољава употребу, дистрибуцију и репродукцију у било ком медијуму, све док коначна употреба није у комерцијалне сврхе и док је претпоставка да је оригинално дело исправно. Референца.
Напомена: Молимо вас да наведете своју адресу е-поште само да би особа коју препоручујете страници знала да желите да види имејл и да то није спам. Нећемо бележити никакве адресе е-поште.
Ово питање се користи да се провери да ли сте посетилац и спречи аутоматско слање спама.
Теорија информација пружа универзалну валуту за поређење посебних метаболома и предвиђање теорија одбране од теста.
Теорија информација пружа универзалну валуту за поређење посебних метаболома и предвиђање теорија одбране од теста.
©2021 Америчко удружење за унапређење науке. сва права задржана. АААС је партнер ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ЦХОРУС, ЦЛОЦКСС, ЦроссРеф и ЦОУНТЕР. СциенцеАдванцес ИССН 2375-2548.