Раније смо известили да су серумски нивои метаболита триптофана индол-3-пропионске киселине (IPA) из црева нижи код пацијената са фиброзом јетре. У овој студији, истраживали смо транскриптом и ДНК метилом код гојазних јетри у односу на серумске нивое IPA, као и улогу IPA у индуковању фенотипске инактивације хепатичних стелатних ћелија (HSCs) in vitro.
Студија је обухватила 116 гојазних пацијената без дијабетес мелитуса типа 2 (ДМ2) (старости 46,8 ± 9,3 године; БМИ: 42,7 ± 5,0 кг/м²) који су подвргнути баријатријској хирургији у Куопио Баријатријском хируршком центру (KOBS). Нивои циркулишућег IPA мерени су течном хроматографијом-масном спектрометријом (LC-MS), анализа транскриптома јетре је извршена секвенцирањем тоталне РНК, а анализа метилације ДНК је извршена помоћу Infinium HumanMethylation450 BeadChip-а. Људске хепатичне стелатне ћелије (LX-2) коришћене су за in vitro експерименте.
Нивои серумског ИПА су били у корелацији са експресијом гена укључених у апоптотске, митофагне и путеве дуговечности у јетри. Ген AKT серин/треонин киназа 1 (AKT1) био је најзаступљенији и доминантни интеракциони ген у профилима транскрипта јетре и метилације ДНК. Третман ИПА је индуковао апоптозу, смањио митохондријално дисање и изменио ћелијску морфологију и митохондријалну динамику модулирањем експресије гена за које се зна да регулишу фиброзу, апоптозу и преживљавање LX-2 ћелија.
Узети заједно, ови подаци потврђују да ИПА има потенцијалне терапеутске ефекте и може индуковати апоптозу и померити ХСЦ фенотип ка неактивном стању, чиме се проширује могућност инхибиције фиброзе јетре ометањем активације ХСЦ и метаболизма митохондрија.
Преваленција гојазности и метаболичког синдрома повезана је са све већом учесталошћу метаболички повезане масне болести јетре (MASLD); болест погађа 25% до 30% опште популације [1]. Главна последица етиологије MASLD-а је фиброза јетре, динамичан процес који карактерише континуирано нагомилавање фиброзног екстрацелуларног матрикса (ECM) [2]. Главне ћелије укључене у фиброзу јетре су хепатичне стелатне ћелије (HSC), које показују четири позната фенотипа: мирујуће, активиране, инактивиране и сенесцентне [3, 4]. HSC се могу активирати и трансдиференцирати из мирујућег облика у пролиферативне ћелије сличне фибробластима са високим енергетским потребама, са повећаном експресијом α-актина глатких мишића (α-SMA) и колагена типа I (Col-I) [5, 6]. Током преокрета фиброзе јетре, активиране HSC се елиминишу путем апоптозе или инактивације. Ови процеси укључују смањење регулације фиброгених гена и модулацију гена који доприносе преживљавању (као што су сигнални путеви NF-κB и PI3K/Akt) [7, 8], као и промене у динамици и функцији митохондрија [9].
Утврђено је да су серумски нивои метаболита триптофана, индол-3-пропионске киселине (IPA), који се производи у цревима, смањени код метаболичких болести код људи, укључујући MASLD [10–13]. IPA је повезан са уносом дијететских влакана, познат је по својим антиоксидативним и антиинфламаторним ефектима и ублажава фенотип неалкохолног стеатохепатитиса (NASH) изазваног исхраном in vivo и in vitro [11–14]. Неки докази потичу из наше претходне студије, која је показала да су серумски нивои IPA били нижи код пацијената са фиброзом јетре него код гојазних пацијената без фиброзе јетре у студији баријатријске хирургије у Куопију (KOBS). Штавише, показали смо да третман IPA може смањити експресију гена који су класични маркери ћелијске адхезије, миграције ћелија и активације хематопоетских матичних ћелија у моделу звездастих ћелија јетре код људи (LX-2) и да је потенцијални хепатопротективни метаболит [15]. Међутим, остаје нејасно како IPA индукује регресију фиброзе јетре активирањем апоптозе HSC и митохондријалне биоенергетике.
Овде показујемо да је серумски IPA повезан са експресијом гена обогаћених апоптозом, митофагијом и путевима дуговечности у јетри гојазних особа које немају дијабетес типа 2 (KOBS). Штавише, открили смо да IPA може да индукује клиренс и разградњу активираних хематопоетских матичних ћелија (HSC) путем пута инактивације. Ови резултати откривају нову улогу IPA, што га чини потенцијалном терапијском метом за подстицање регресије фиброзе јетре.
Претходна студија у кохорти KOBS показала је да пацијенти са фиброзом јетре имају ниже нивое IPA у циркулацији у поређењу са пацијентима без фиброзе јетре [15]. Да бисмо искључили потенцијални збуњујући ефекат дијабетеса типа 2, регрутовали смо 116 гојазних пацијената без дијабетеса типа 2 (просечна старост ± SD: 46,8 ± 9,3 године; БМИ: 42,7 ± 5,0 кг/м2) (Табела 1) из текуће KOBS студије као популацију студије [16]. Сви учесници су дали писани информисани пристанак, а протокол студије је одобрио Етички комитет болнице округа Северни Саво у складу са Хелсиншком декларацијом (54/2005, 104/2008 и 27/2010).
Узорци биопсије јетре су добијени током баријатријске хирургије и хистолошки су их проценили искусни патолози према претходно описаним критеријумима [17, 18]. Критеријуми процене су сумирани у Додатној табели S1 и претходно су описани [19].
Узорци серума на гладно анализирани су нециљаном течном хроматографијом-масном спектрометријом (LC-MS) за метаболомску анализу (n = 116). Узорци су анализирани коришћењем UHPLC-qTOF-MS система (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Немачка) као што је претходно описано19. Идентификација изопропил алкохола (IPA) заснована је на времену задржавања и поређењу MS/MS спектра са чистим стандардима. Интензитет IPA сигнала (површина пика) је узет у обзир у свим даљим анализама [20].
Секвенцирање целе РНК јетре је извршено помоћу Illumina HiSeq 2500, а подаци су претходно обрађени као што је претходно описано [19, 21, 22]. Извршили смо циљану анализу диференцијалне експресије транскрипата који утичу на митохондријалну функцију/биогенезу користећи 1957 гена одабраних из базе података MitoMiner 4.0 [23]. Анализа метилације ДНК јетре је извршена помоћу Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан Дијего, Калифорнија, САД) користећи исту методологију као што је претходно описано [24, 25].
Људске хепатичне стелатне ћелије (LX-2) љубазно је обезбедио проф. Стефано Ромео и култивисане су и одржаване у DMEM/F12 медијуму (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Да би се одабрала радна доза IPA, LX-2 ћелије су третиране различитим концентрацијама IPA (10 μM, 100 μM и 1 mM; Sigma, 220027) у DMEM/F12 медијуму током 24 сата. Штавише, да би се испитала способност IPA да инактивира HSC, LX-2 ћелије су ко-третиране са 5 нг/мл TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) и 1 mM IPA у медијуму без серума током 24 сата. За одговарајуће контроле носача, 4 нМ HCl који садржи 0,1% BSA је коришћен за третман TGF-β1 и 0,05% DMSO је коришћено за третман IPA, и оба су коришћена заједно за комбиновани третман.
Апоптоза је процењена коришћењем FITC комплета за детекцију апоптозе анексина V са 7-AAD (Biolegend, Сан Дијего, Калифорнија, САД, кат. бр. 640922) према упутствима произвођача. Укратко, LX-2 (1 × 105 ћелија/бунарчић) су култивисане преко ноћи у плочама са 12 бунарчића, а затим третиране вишеструким дозама IPA или IPA и TGF-β1. Следећег дана, плутајуће и адхерентне ћелије су сакупљене, трипсинизоване, испране са PBS, ресуспендоване у пуферу за везивање анексина V и инкубиране са FITC-анексином V и 7-AAD током 15 минута.
Митохондрије у живим ћелијама су обојене на оксидативну активност коришћењем Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорнија). За MTR тестове, LX-2 ћелије су инкубиране при једнаким густинама са IPA и TGF-β1. Након 24 сата, живе ћелије су трипсинизиране, испране са PBS, а затим инкубиране са 100 μM MTR у медијуму без серума на 37 °C током 20 минута, као што је претходно описано [26]. За анализу морфологије живих ћелија, величина ћелија и цитоплазматска сложеност су анализиране коришћењем параметара директног расејања (FSC) и бочног расејања (SSC), респективно.
Сви подаци (30.000 догађаја) су прикупљени коришћењем NovoCyte Quanteon (Agilent) и анализирани коришћењем софтвера NovoExpress® 1.4.1 или FlowJo V.10.
Брзина потрошње кисеоника (OCR) и брзина екстрацелуларне ацидификације (ECAR) мерене су у реалном времену помоћу Seahorse Extracellular Flux Analyzer-а (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорнија) опремљеног Seahorse XF Cell Mito Stress-ом према упутствима произвођача. Укратко, 2 × 10⁴ LX-2 ћелија/бунарчић је посејано на XF96 плоче за ћелијску културу. Након инкубације преко ноћи, ћелије су третиране изопропанолом (IPA) и TGF-β1 (Допунске методе 1). Анализа података је извршена помоћу Seahorse XF Wave софтвера, који укључује Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Из овога је израчунат биоенергетски здравствени индекс (BHI) [27].
Укупна РНК је транскрибована у цДНК. За специфичне методе, видети референцу [15]. Нивои мРНК људског 60S рибозомског киселог протеина P0 (RPLP0) и циклофилина A1 (PPIA) коришћени су као конститутивне контроле гена. Коришћен је QuantStudio 6 pro Real-Time PCR систем (Thermo Fisher, Landsmeer, Холандија) са TaqMan™ Fast Advanced Master Mix комплетом (Applied Biosystems) или Sensifast SYBR Lo-ROX комплетом (Bioline, BIO 94050), а релативни прегиб експресије гена израчунат је коришћењем упоредних параметара циклуса вредности Ct (ΔΔCt) и методе ∆∆Ct. Детаљи о прајмерима дати су у додатним табелама S2 и S3.
Нуклеарна ДНК (нкДНК) и митохондријална ДНК (мтДНК) су екстраховане коришћењем DNeasy комплета за крв и ткиво (Qiagen) као што је претходно описано [28]. Релативна количина мтДНК је израчуната израчунавањем односа сваког циљног региона мтДНК и геометријске средине три региона нуклеарне ДНК (мтДНК/нкДНК), као што је детаљно описано у Додатним методама 2. Детаљи о прајмерима за мтДНК и нкДНК дати су у Додатној табели С4.
Живе ћелије су обојене са Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорнија) да би се визуализовале међућелијске и интрацелуларне митохондријалне мреже. LX-2 ћелије (1 × 10⁴ ћелија/бунарчић) су култивисане на стакленим плочицама у одговарајућим плочама за култивацију са стакленим дном (Ibidi GmbH, Мартинсрид, Немачка). Након 24 сата, живе LX-2 ћелије су инкубиране са 100 μM MTR током 20 минута на 37 °C, а ћелијска језгра су обојена са DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) као што је претходно описано [29]. Митохондријалне мреже су визуализоване помоћу инвертованог микроскопа Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Јена, Немачка) опремљеног конфокалним модулом Zeiss LSM 800 на 37 °C у влажној атмосфери са 5% CO2 користећи објектив 63×NA 1.3. Добили смо десет слика Z-серије за сваки тип узорка. Свака Z-серија садржи 30 пресека, сваки дебљине 9,86 μm. За сваки узорак, слике десет различитих видних поља су снимљене коришћењем ZEN 2009 софтвера (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Јена, Немачка), а анализа митохондријалне морфологије је извршена коришћењем ImageJ софтвера (v1.54d) [30, 31] према параметрима детаљно описаним у Додатним методама 3.
Ћелије су фиксиране са 2% глутаралдехидом у 0,1 М фосфатном пуферу, након чега је уследила фиксација са 1% раствором осмијум тетроксида (Sigma Aldrich, MO, САД), постепено дехидриране ацетоном (Merck, Дармштат, Немачка) и коначно уграђене у епоксидну смолу. Ултратанки пресеци су припремљени и обојени са 1% уранил ацетатом (Merck, Дармштат, Немачка) и 1% олово цитратом (Merck, Дармштат, Немачка). Ултраструктурне слике су добијене коришћењем трансмисионог електронског микроскопа JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Токио, Јапан) при убрзавајућем напону од 80 kV.
Морфологија LX-2 ћелија третираних IPA током 24 сата анализирана је фазно-контрастном микроскопијом при увећању од 50 пута коришћењем Zeiss инвертованог светлосног микроскопа (Zeiss Axio Vert.A1 и AxioCam MRm, Јена, Немачка).
Клинички подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација или медијана (интерквартилни распон: IQR). Једносмерна анализа варијансе (континуиране променљиве) или χ² тест (категоријалне променљиве) коришћени су за поређење разлика између три студијске групе. Стопа лажно позитивних резултата (FDR) коришћена је за корекцију вишеструког тестирања, а гени са FDR < 0,05 сматрани су статистички значајним. Спирманова корелациона анализа коришћена је за корелацију CpG ДНК метилације са интензитетом IPA сигнала, са приказаним номиналним p вредностима (p < 0,05).
Анализа путање је спроведена коришћењем веб-базираног алата за анализу скупова гена (WebGestalt) за 268 транскрипата (номинално p < 0,01), 119 транскрипата повезаних са митохондријама (номинално p < 0,05) и 4350 CpG од 3093 транскрипата јетре који су били повезани са нивоима IPA у циркулацији у серуму. За проналажење преклапајућих гена коришћен је слободно доступан алат Venny DB (верзија 2.1.0), а за визуелизацију протеин-протеин интеракција коришћен је StringDB (верзија 11.5).
За LX-2 експеримент, узорци су тестирани на нормалност коришћењем Д'Агостино-Пирсоновог теста. Подаци су добијени из најмање три биолошка понављања и подвргнути једнофакторској ANOVA са Бонферонијевим post hoc тестом. p-вредност мања од 0,05 сматрана је статистички значајном. Подаци су представљени као средња вредност ± SD, а број експеримената је назначен на свакој слици. Све анализе и графикони су извршени коришћењем статистичког софтвера GraphPad Prism 8 за Windows (GraphPad Software Inc., верзија 8.4.3, Сан Дијего, САД).
Прво, истражили смо повезаност нивоа IPA у серуму са транскриптима јетре, целог тела и митохондријалним транскриптима. У укупном профилу транскрипта, најјачи ген повезан са нивоима IPA у серуму био је MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; протеин киназа активирана митогеном 3); у профилу транскрипта повезаном са митохондријама, најјачи повезани ген био је AKT1 (FDR = 0,7621; AKT серин/треонин киназа 1) (Додатна датотека 1 и Додатна датотека 2).
Затим смо анализирали глобалне транскрипте (n = 268; p < 0,01) и транскрипте повезане са митохондријама (n = 119; p < 0,05), на крају идентификујући апоптозу као најзначајнији канонски пут (p = 0,0089). За митохондријалне транскрипте повезане са нивоима IPA у серуму, фокусирали смо се на апоптозу (FDR = 0,00001), митофагију (FDR = 0,00029) и TNF сигналне путеве (FDR = 0,000006) (Слика 1А, Табела 2 и додатне слике 1А-Б).
Анализа преклапања глобалних, митохондријално повезаних транскрипата и метилације ДНК у људској јетри у вези са нивоима IPA у серуму. А представља 268 глобалних транскрипата, 119 транскрипата повезаних са митохондријама и метилиране транскрипте ДНК који су мапирани на 3092 CpG места повезана са нивоима IPA у серуму (p вредности < 0,01 за глобалне транскрипте и метилирану ДНК, и p вредности < 0,05 за митохондријалне транскрипте). Главни преклапајући транскрипти су приказани у средини (AKT1 и YKT6). Б Мапа интеракције 13 гена са највишим резултатом интеракције (0,900) са другим генима је конструисана од 56 преклапајућих гена (регион црне линије) који су били значајно повезани са нивоима IPA у серуму коришћењем онлајн алата StringDB. Зелена: Гени мапирани на ћелијску компоненту Gene Ontology (GO): митохондрије (GO:0005739). AKT1 је протеин са највишим резултатом (0,900) за интеракције са другим протеинима на основу података (на основу анализе текста, експеримената, база података и коекспресије). Чворови мреже представљају протеине, а ивице везе између протеина.
Пошто метаболити цревне микробиоте могу регулисати епигенетски састав путем метилације ДНК [32], истражили смо да ли су нивои IPA у серуму повезани са метилацијом ДНК јетре. Открили смо да су два главна места метилације повезана са нивоима IPA у серуму близу региона 3 богатог пролин-серином (C19orf55) и члана 6 породице протеина топлотног шока Б (мали) (HSPB6) (Додатна датотека 3). Метилација ДНК 4350 CpG (p < 0,01) била је у корелацији са нивоима IPA у серуму и обогаћена је регулаторним путевима дуговечности (p = 0,006) (Слика 1А, Табела 2 и Додатна слика 1Ц).
Да бисмо разумели биолошке механизме који леже у основи повезаности између нивоа IPA у серуму, глобалних транскрипата, транскрипата повезаних са митохондријама и метилације ДНК у људској јетри, извршили смо анализу преклапања гена идентификованих у претходној анализи путање (Слика 1А). Резултати анализе обогаћивања путање 56 преклапајућих гена (унутар црне линије на Слици 1А) показали су да је пут апоптозе (p = 0,00029) истакао два гена заједничка за три анализе: AKT1 и YKT6 (YKT6 v-SNARE хомолог), као што је приказано на Веновом дијаграму (Допунска слика 2 и Слика 1А). Занимљиво је да смо открили да су AKT1 (cg19831386) и YKT6 (cg24161647) позитивно корелирани са нивоима IPA у серуму (Додатна датотека 3). Да бисмо идентификовали потенцијалне протеинске интеракције између генских производа, одабрали смо 13 гена са највећим резултатом заједничког региона (0,900) међу 56 преклапајућих гена као улаз и конструисали мапу интеракције. Према нивоу поузданости (маргинално поуздање), ген AKT1 са највишим резултатом (0,900) био је на врху (слика 1Б).
На основу анализе путање, открили смо да је апоптоза главни пут, па смо истражили да ли ће третман IPA утицати на апоптозу HSC ћелија in vitro. Претходно смо показали да различите дозе IPA (10 μM, 100 μM и 1 mM) нису токсичне за LX-2 ћелије [15]. Ова студија је показала да третман IPA са 10 μM и 100 μM повећава број одрживих и некротичних ћелија. Међутим, у поређењу са контролном групом, одрживост ћелија се смањила при концентрацији IPA од 1 mM, док је стопа некрозе ћелија остала непромењена (Слика 2А, Б). Затим, да бисмо пронашли оптималну концентрацију за индуковање апоптозе у LX-2 ћелијама, тестирали смо IPA од 10 μM, 100 μM и 1 mM током 24 сата (Слика 2А-Е и Додатна слика 3А-Б). Занимљиво је да су IPA 10 μM и 100 μM смањили стопу апоптозе (%), међутим, IPA 1 mM је повећао касну апоптозу и стопу апоптозе (%) у поређењу са контролом и стога је изабран за даље експерименте (слике 2A–D).
IPA индукује апоптозу LX-2 ћелија. Метода двоструког бојења са Анексином V и 7-AAD коришћена је за квантификацију стопе апоптозе и морфологије ћелија проточном цитометријом. BA ћелије су инкубиране са 10 μM, 100 μM и 1 mM IPA током 24 сата или са F–H TGF-β1 (5 нг/мл) и 1 mM IPA у медијуму без серума током 24 сата. А: живе ћелије (Анексин V -/ 7AAD-); Б: некротичне ћелије (Анексин V -/ 7AAD+); Ц, Ф: ране (Анексин V +/ 7AAD-); Д, Г: касне (Анексин V+/7AAD.+); Е, Х: проценат укупних раних и касних апоптотских ћелија у стопи апоптозе (%). Подаци су изражени као средња вредност ± SD, n = 3 независна експеримента. Статистичка поређења су извршена коришћењем једносмерне ANOVA са Бонферонијевим пост хок тестом. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Као што смо претходно показали, 5 нг/мл TGF-β1 може индуковати активацију HSC ћелија повећањем експресије класичних маркер гена [15]. LX-2 ћелије су третиране са 5 нг/мл TGF-β1 и 1 mM IPA у комбинацији (Сл. 2E–H). Третман TGF-β1 није променио стопу апоптозе, међутим, ко-третман IPA је повећао касну апоптозу и стопу апоптозе (%) у поређењу са третманом TGF-β1 (Сл. 2E–H). Ови резултати указују да 1 mM IPA може промовисати апоптозу у LX-2 ћелијама независно од индукције TGF-β1.
Даље смо истражили ефекат IPA на митохондријално дисање у LX-2 ћелијама. Резултати су показали да је 1 mM IPA смањио параметре брзине потрошње кисеоника (OCR): немитохондријално дисање, базално и максимално дисање, цурење протона и производњу АТП-а у поређењу са контролном групом (Слика 3А, Б), док се биоенергетски индекс здравља (BHI) није променио.
IPA смањује митохондријално дисање у LX-2 ћелијама. Крива митохондријалног дисања (OCR) је представљена као параметри митохондријалног дисања (немитохондријално дисање, базално дисање, максимално дисање, цурење протона, стварање АТП-а, SRC и BHI). Ћелије А и Б су инкубиране са 10 μM, 100 μM и 1 mM IPA током 24 сата, респективно. Ћелије C и D су инкубиране са TGF-β1 (5 нг/мл) и 1 mM IPA у медијуму без серума током 24 сата, респективно. Сва мерења су нормализована на садржај ДНК коришћењем CyQuant комплета. BHI: биоенергетски индекс здравља; SRC: респираторни резервни капацитет; OCR: брзина потрошње кисеоника. Подаци су представљени као средња вредност ± стандардна девијација (SD), n = 5 независних експеримената. Статистичка поређења су извршена коришћењем једносмерне ANOVA и Bonferroni post hoc теста. *p < 0,05; **p < 0,01; и ***p < 0,001
Да бисмо стекли свеобухватније разумевање ефекта IPA на биоенергетски профил LX-2 ћелија активираних TGF-β1, анализирали смо митохондријалну оксидативну фосфорилацију помоћу OCR (Сл. 3C,D). Резултати су показали да третман TGF-β1 може смањити максимално дисање, респираторни резервни капацитет (SRC) и BHI у поређењу са контролном групом (Сл. 3C,D). Поред тога, комбиновани третман је смањио базално дисање, цурење протона и производњу АТП-а, али су SRC и BHI били значајно виши него код оних третираних са TGF-β1 (Сл. 3C,D).
Такође смо спровели „Тест фенотипа ћелијске енергије“ који је обезбедио Seahorse софтвер (Допунска слика 4A–D). Као што је приказано на Додатној слици 3B, метаболички потенцијали и OCR и ECAR су смањени након третмана TGF-β1, међутим, није примећена разлика у групама са комбинованим и IPA третманом у поређењу са контролном групом. Штавише, и базални и нивои стреса OCR су смањени након третмана комбинованим и IPA у поређењу са контролном групом (Допунска слика 4C). Занимљиво је да је сличан образац примећен и код комбиноване терапије, где није примећена промена у базалним и нивоима стреса ECAR у поређењу са третманом TGF-β1 (Допунска слика 4C). Код HSC, смањење митохондријалне оксидативне фосфорилације и способност комбинованог третмана да обнови SCR и BHI након излагања третману TGF-β1 нису променили метаболички потенцијал (OCR и ECAR). Узети заједно, ови резултати указују да IPA може смањити биоенергетику у HSC, што сугерише да IPA може индуковати нижи енергетски профил који помера HSC фенотип ка инактивацији (Допунска слика 4D).
Ефекат IPA на динамику митохондрија испитан је коришћењем тродимензионалне квантификације митохондријалне морфологије и мрежних веза, као и MTR бојења (слика 4 и додатна слика 5). Слика 4 показује да је, у поређењу са контролном групом, третман TGF-β1 смањио средњу површину, број грана, укупну дужину грана и број спојева грана (слика 4А и Б) и променио удео митохондрија од сферне до средње морфологије (слика 4Ц). Само третман IPA је смањио средњу запремину митохондрија и променио удео митохондрија од сферне до средње морфологије у поређењу са контролном групом (слика 4А). Насупрот томе, сферичност, средња дужина грана и митохондријална активност процењена MTR-ом зависним од потенцијала митохондријалне мембране (слика 4А и Е) остали су непромењени и ови параметри се нису разликовали између група. Узети заједно, ови резултати сугеришу да третман TGF-β1 и IPA изгледа модулирају облик и величину митохондрија, као и сложеност мреже у живим LX-2 ћелијама.
IPA мења митохондријалну динамику и обиље митохондријалне ДНК у LX-2 ћелијама. А. Репрезентативне конфокалне слике живих LX-2 ћелија инкубираних са TGF-β1 (5 нг/мл) и 1 mM IPA током 24 сата у медијуму без серума, приказујући митохондријалне мреже обојене са Mitotracker™ Red CMXRos и језгра обојена плаво са DAPI. Сви подаци садрже најмање 15 слика по групи. Добили смо 10 Z-стек слика за сваки тип узорка. Свака Z-оса секвенца садржала је 30 пресека, сваки дебљине 9,86 μm. Скала: 10 μm. Б. Репрезентативни објекти (само митохондрије) идентификовани применом адаптивног прага на слику. Квантитативна анализа и поређење веза митохондријалне морфолошке мреже извршени су за све ћелије у свакој групи. Ц. Учесталост односа облика митохондрија. Вредности близу 0 означавају сферне облике, а вредности близу 1 означавају филаментозне облике. Д Садржај митохондријалне ДНК (mtDNA) одређен је као што је описано у Материјалима и методама. Анализа E Mitotracker™ Red CMXRos је спроведена проточном цитометријом (30.000 догађаја) као што је описано у одељку Материјали и методе. Подаци су представљени као средња вредност ± SD, n = 3 независна експеримента. Статистичка поређења су спроведена коришћењем једнофакторске ANOVA и Bonferroni post hoc теста. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Затим смо анализирали садржај мтДНК у LX-2 ћелијама као индикатор броја митохондрија. У поређењу са контролном групом, садржај мтДНК је био повећан у групи третираној TGF-β1 (Слика 4D). У поређењу са групом третираном TGF-β1, садржај мтДНК је био смањен у групи комбинованог третмана (Слика 4D), што сугерише да IPA може смањити садржај мтДНК и могуће број митохондрија, као и митохондријално дисање (Слика 3C). Штавише, чини се да је IPA смањио садржај мтДНК у комбинованом третману, али није утицао на митохондријалну активност посредовану MTR-ом (Слике 4A–C).
Истраживали смо повезаност IPA са нивоима mRNA гена повезаних са фиброзом, апоптозом, преживљавањем и динамиком митохондрија у LX-2 ћелијама (Слика 5A–D). У поређењу са контролном групом, група третирана TGF-β1 показала је повећану експресију гена као што су колаген типа I α2 ланац (COL1A2), α-актин глатких мишића (αSMA), матриксна металопротеиназа 2 (MMP2), ткивни инхибитор металопротеиназе 1 (TIMP1) и ген сличан динамину 1 (DRP1), што указује на повећану фиброзу и активацију. Штавише, у поређењу са контролном групом, третман TGF-β1 смањио је нивое mRNA нуклеарног прегнан X рецептора (PXR), каспазе 8 (CASP8), MAPKAPK3, инхибитора B-ћелијског α, појачивача светлосног пептида гена нуклеарног фактора κ (NFκB1A) и инхибитора подјединице киназе нуклеарног фактора κB β (IKBKB) (Слика 5A–D). У поређењу са третманом TGF-β1, комбиновани третман са TGF-β1 и IPA смањио је експресију COL1A2 и MMP2, али је повећао нивое mRNA PXR, TIMP1, B-ћелијског лимфома-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β и IKBKB. IPA третман је значајно смањио експресију MMP2, Bcl-2-асоцираног протеина X (BAX), AKT1, протеина оптичке атрофије 1 (OPA1) и митохондријалног фузионог протеина 2 (MFN2), док је експресија CASP8, NFκB1A, NFκB1B и IKBKB била повећана у поређењу са контролном групом. Међутим, није пронађена разлика у експресији каспазе-3 (CASP3), фактора активирања апоптотске пептидазе 1 (APAF1), митохондријалног фузионог протеина 1 (MFN1) и фисионог протеина 1 (FIS1). Заједно, ови резултати указују на то да IPA третман модулира експресију гена повезаних са фиброзом, апоптозом, преживљавањем и динамиком митохондрија. Наши подаци указују на то да IPA третман смањује фиброзу у LX-2 ћелијама; истовремено, стимулише преживљавање померањем фенотипа ка инактивацији.
IPA модулира експресију фибробластних, апоптотских, вијабилних и гена митохондријалне динамике у LX-2 ћелијама. Хистограми приказују експресију mRNA у односу на ендогену контролу (RPLP0 или PPIA) након што су LX-2 ћелије индуковане са TGF-β1 и IPA у медијуму без серума током 24 сата. А означава фибробласте, Б ​​означава апоптотичке ћелије, Ц означава преживеле ћелије, а D означава експресију гена митохондријалне динамике. Подаци су представљени као средња вредност ± стандардна девијација (SD), n = 3 независна експеримента. Статистичка поређења су извршена коришћењем једносмерне ANOVA и Bonferroni post hoc теста. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Затим су промене у величини ћелија (FSC-H) и цитоплазматској сложености (SSC-H) процењене проточном цитометријом (слика 6А,Б), а промене у морфологији ћелија након IPA третмана процењене су трансмисионом електронском микроскопијом (TEM) и фазно-контрастном микроскопијом (додатна слика 6А-Б). Као што се и очекивало, ћелије у групи третираној TGF-β1 су се повећале у поређењу са контролном групом (слика 6А,Б), показујући класично ширење грубог ендоплазматског ретикулума (ER*) и фаголизозома (P), што указује на активацију хематопоетских матичних ћелија (HSC) (додатна слика 6А). Међутим, у поређењу са групом третираном TGF-β1, величина ћелија, цитоплазматска сложеност (слика 6А,Б) и садржај ER* су смањени у групи која је примала комбиновани третман TGF-β1 и IPA (додатна слика 6А). Штавише, IPA третман је смањио величину ћелија, цитоплазматску сложеност (слике 6А,Б), садржај P и ER* (додатна слика 6А) у поређењу са контролном групом. Поред тога, садржај апоптотских ћелија се повећао након 24 сата третмана IPA у поређењу са контролном групом (беле стрелице, додатна слика 6Б). Заједно, ови резултати сугеришу да 1 mM IPA може стимулисати апоптозу HSC и преокренути промене у морфолошким параметрима ћелија изазване TGF-β1, чиме се регулише величина и сложеност ћелија, што може бити повезано са инактивацијом HSC.
IPA мења величину ћелија и цитоплазматску сложеност у LX-2 ћелијама. Репрезентативне слике анализе проточне цитометрије. Анализа је користила стратегију гејтинга специфичну за LX-2 ћелије: SSC-A/FSC-A за дефинисање ћелијске популације, FSC-H/FSC-A за идентификацију дублета и SSC-H/FSC-H за анализу величине и сложености ћелија. Ћелије су инкубиране са TGF-β1 (5 нг/мл) и 1 mM IPA у медијуму без серума током 24 сата. LX-2 ћелије су распоређене у доњи леви квадрант (SSC-H-/FSC-H-), горњи леви квадрант (SSC-H+/FSC-H-), доњи десни квадрант (SSC-H-/FSC-H+) и горњи десни квадрант (SSC-H+/FSC-H+) за анализу величине ћелија и цитоплазматске сложености. Б. Морфологија ћелија је анализирана проточном цитометријом коришћењем FSC-H (директно расејање, величина ћелије) и SSC-H (бочно расејање, цитоплазматска сложеност) (30.000 догађаја). Подаци су представљени као средња вредност ± SD, n = 3 независна експеримента. Статистичка поређења су извршена коришћењем једнофакторске ANOVA и Bonferroni post hoc теста. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 и ****p < 0,0001
Метаболити црева, попут ИПА, постали су врућа тема истраживања, што сугерише да би се нове мете могле открити у цревној микробиоти. Стога је занимљиво да се ИПА, метаболит који смо повезали са фиброзом јетре код људи [15], показао као потенцијално антифибротично једињење у животињским моделима [13, 14]. Овде први пут демонстрирамо везу између серумског ИПА и глобалне транскриптомике јетре и метилације ДНК код гојазних особа без дијабетеса типа 2 (Т2Д), истичући апоптозу, митофагију и дуговечност, као и могући кандидат ген АКТ1 који регулише хомеостазу јетре. Још једна новина наше студије је да смо показали интеракцију третмана ИПА са апоптозом, ћелијском морфологијом, митохондријалном биоенергетиком и динамиком у LX-2 ћелијама, што указује на нижи енергетски спектар који помера HSC фенотип ка инактивацији, чинећи ИПА потенцијалним кандидатом за побољшање фиброзе јетре.
Открили смо да су апоптоза, митофагија и дуговечност најважнији канонски путеви обогаћени генима јетре повезаним са циркулишућим серумским IPA. Поремећај система контроле квалитета митохондрија (MQC) може довести до митохондријалне дисфункције, митофагије и апоптозе, чиме се подстиче појава MASLD [33, 34]. Стога можемо претпоставити да IPA може бити укључена у одржавање ћелијске динамике и интегритета митохондрија путем апоптозе, митофагије и дуговечности у јетри. Наши подаци су показали да су два гена била заједничка у три теста: YKT6 и AKT1. Вреди напоменути да је YKT6 SNARE протеин укључен у процес фузије ћелијских мембрана. Он игра улогу у аутофагији и митофагији формирањем иницијационог комплекса са STX17 и SNAP29 на аутофагозому, чиме се подстиче фузија аутофагозома и лизозома [35]. Штавише, губитак функције YKT6 доводи до оштећене митофагије [36], док је повећана регулација YKT6 повезана са прогресијом хепатоцелуларног карцинома (HCC), што показује повећано преживљавање ћелија [37]. С друге стране, AKT1 је најважнији интеракциони ген и игра важну улогу у болестима јетре, укључујући PI3K/AKT сигнални пут, ћелијски циклус, миграцију ћелија, пролиферацију, фокалну адхезију, митохондријалну функцију и лучење колагена [38–40]. Активирани PI3K/AKT сигнални пут може активирати хематопоетске матичне ћелије (HSC), које су ћелије одговорне за производњу екстрацелуларног матрикса (ECM), а његова дисрегулација може допринети појави и прогресији фиброзе јетре [40]. Поред тога, AKT је један од кључних фактора преживљавања ћелија који инхибира p53-зависну апоптозу ћелија, а активација AKT може бити повезана са инхибицијом апоптозе ћелија јетре [41, 42]. Добијени резултати сугеришу да IPA може бити укључен у апоптозу повезану са митохондријама јетре тако што утиче на одлуку хепатоцита између уласка у апоптозу или преживљавања. Ови ефекти могу бити регулисани AKT и/или YKT6 кандидат генима, који су критични за хомеостазу јетре.
Наши резултати су показали да је 1 mM IPA индуковао апоптозу и смањио митохондријално дисање у LX-2 ћелијама независно од третмана TGF-β1. Важно је напоменути да је апоптоза главни пут за решавање фиброзе и активацију хематопоетских матичних ћелија (HSC), а такође је и кључни догађај у реверзибилном физиолошком одговору на фиброзу јетре [4, 43]. Штавише, обнављање BHI у LX-2 ћелијама након комбинованог третмана пружило је нове увиде у потенцијалну улогу IPA у регулацији митохондријалне биоенергетике. У условима мировања и неактивности, хематопоетске ћелије нормално користе митохондријалну оксидативну фосфорилацију за производњу АТП-а и имају ниску метаболичку активност. С друге стране, активација HSC побољшава митохондријално дисање и биосинтезу како би компензовала енергетске потребе уласка у гликолитичко стање [44]. Чињеница да IPA није утицао на метаболички потенцијал и ECAR сугерише да је гликолитички пут мање приоритетан. Слично томе, друга студија је показала да је 1 mM IPA био у стању да модулира активност митохондријалног респираторног ланца у кардиомиоцитима, ћелијској линији људских хепатоцита (Huh7) и ендотелним ћелијама људске пупчане вене (HUVEC); Међутим, није пронађен ефекат IPA на гликолизу у кардиомиоцитима, што сугерише да IPA може утицати на биоенергетику других типова ћелија [45]. Стога претпостављамо да 1 mM IPA може деловати као благи хемијски раздвајач, јер може значајно смањити експресију фиброгених гена, морфологију ћелија и митохондријалну биоенергетику без промене количине mtDNA [46]. Митохондријални раздвајачи могу инхибирати фиброзу индуковану културом и активацију HSC [47] и смањити производњу митохондријалног АТП-а регулисану или индуковану одређеним протеинима као што су протеини за раздвајање (UCP) или аденин нуклеотидна транслоказа (ANT). У зависности од типа ћелије, овај феномен може заштитити ћелије од апоптозе и/или подстаћи апоптозу [46]. Међутим, потребна су даља истраживања како би се разјаснила улога IPA као митохондријалног раздвајача у инактивацији хематопоетских матичних ћелија.
Затим смо истражили да ли се промене у митохондријалном дисању одражавају на митохондријалну морфологију у живим LX-2 ћелијама. Занимљиво је да третман TGF-β1 мења митохондријалну пропорцију од сферне до средње, са смањеним митохондријалним гранањем и повећаном експресијом DRP1, кључног фактора у митохондријалној фисији [48]. Штавише, фрагментација митохондрија је повезана са укупном сложеношћу мреже, а прелазак са фузије на фисију је критичан за активацију хематопоетских матичних ћелија (HSC), док инхибиција митохондријалне фисије доводи до апоптозе HSC [49]. Дакле, наши резултати указују да третман TGF-β1 може изазвати смањење сложености митохондријалне мреже са смањеним гранањем, што је чешће код митохондријалне фисије повезане са активираним хематопоетским матичним ћелијама (HSC). Штавише, наши подаци су показали да IPA може променити пропорцију митохондрија од сферне до средње облика, чиме се смањује експресија OPA1 и MFN2. Студије су показале да смањење OPA1 може изазвати смањење потенцијала митохондријалне мембране и покренути апоптозу ћелија [50]. Познато је да MFN2 посредује у митохондријалној фузији и апоптози [51]. Добијени резултати указују на то да индукција LX-2 ћелија помоћу TGF-β1 и/или IPA изгледа модулира облик и величину митохондрија, као и стање активације и сложеност мреже.
Наши резултати указују да комбиновани третман TGFβ-1 и IPA може смањити параметре мтДНК и морфологије ћелија регулисањем експресије мРНК гена фиброзе, апоптозе и гена повезаних са преживљавањем у ћелијама које избегавају апоптозу. Заиста, IPA је смањио ниво експресије мРНК AKT1 и важних гена фиброзе као што су COL1A2 и MMP2, али је повећао ниво експресије CASP8, који је повезан са апоптозом. Наши резултати су показали да је након третмана IPA, експресија BAX смањена, а експресија мРНК подјединица породице TIMP1, BCL-2 и NF-κB повећана, што сугерише да IPA може стимулисати сигнале преживљавања у хематопоетским матичним ћелијама (HSC) које избегавају апоптозу. Ови молекули могу деловати као сигнали за преживљавање у активираним хематопоетским матичним ћелијама, што може бити повезано са повећаном експресијом антиапоптотских протеина (као што је Bcl-2), смањеном експресијом проапоптотског BAX и сложеном интеракцијом између TIMP и NF-κB [5, 7]. IPA испољава своје ефекте путем PXR-а, и открили смо да комбиновани третман са TGF-β1 и IPA повећава нивое експресије PXR mRNA, што указује на супресију активације HSC. Познато је да активирана PXR сигнализација инхибира активацију HSC-а и in vivo и in vitro [52, 53]. Наши резултати указују да IPA може учествовати у клиренсу активираних HSC-а промовишући апоптозу, смањујући фиброзу и метаболизам митохондрија и побољшавајући сигнале преживљавања, што су типични процеси који претварају активирани HSC фенотип у инактивирани. Још једно могуће објашњење за потенцијални механизам и улогу IPA у апоптози је да он чисти дисфункционалне митохондрије првенствено путем митофагије (унутрашњи пут) и спољашњег TNF сигналног пута (Табела 1), који је директно повезан са NF-κB сигналним путем преживљавања (Допунска слика 7). Занимљиво је да су гени обогаћени IPA-ом способни да индукују про-апоптотичке и про-преживљавајуће сигнале у апоптотском путу [54], што сугерише да IPA може индуковати апоптотски пут или преживљавање интеракцијом са овим генима. Међутим, како ИПА индукује апоптозу или преживљавање током активације ХСЦ и његови механистички путеви остају нејасни.
IPA је микробни метаболит који се формира из триптофана из исхране путем цревне микробиоте. Студије су показале да има антиинфламаторна, антиоксидативна и епигенетска регулаторна својства у цревној средини.[55] Студије су показале да IPA може модулирати функцију цревне баријере и смањити оксидативни стрес, што може допринети његовим локалним физиолошким ефектима.[56] У ствари, IPA се транспортује до циљних органа путем циркулације, а пошто IPA дели сличну структуру главног метаболита са дериватима триптофана, серотонина и индола, IPA врши метаболичке активности које резултирају конкурентном метаболичком судбином.[52] IPA може да се такмичи са метаболитима изведеним из триптофана за места везивања на ензимима или рецепторима, потенцијално реметећи нормалне метаболичке путеве. Ово истиче потребу за даљим истраживањима његове фармакокинетике и фармакодинамике како би се боље разумео његов терапеутски прозор.[57] Остаје да се види да ли се ово може десити и у хематопоетским матичним ћелијама (HSC).
Свесни смо да наша студија има нека ограничења. Да бисмо посебно испитали повезаност са IPA, искључили смо пацијенте са дијабетесом мелитусом типа 2 (T2DM). Свесни смо да ово ограничава широку применљивост наших налаза на пацијенте са дијабетесом мелитусом типа 2 и узнапредовалом болешћу јетре. Иако је физиолошка концентрација IPA у људском серуму 1–10 μM [11, 20], концентрација од 1 mM IPA је изабрана на основу највише нетоксичне концентрације [15] и највише стопе апоптозе, без разлике у проценту популације некротичних ћелија. Иако су у овој студији коришћени супрафизиолошки нивои IPA, тренутно не постоји консензус у вези са ефективном дозом IPA [52]. Иако су наши резултати значајни, шира метаболичка судбина IPA остаје активно подручје истраживања. Штавише, наши налази о повезаности између нивоа IPA у серуму и метилације ДНК транскрипата јетре добијени су не само из хематопоетских матичних ћелија (HSC) већ и из ткива јетре. Одабрали смо да користимо људске LX-2 ћелије на основу наших претходних налаза из анализе транскриптома да је IPA повезана са активацијом хематопоетских матичних ћелија (HSC) [15], а HSC су главне ћелије укључене у прогресију фиброзе јетре. Јетра се састоји од више типова ћелија, тако да би други ћелијски модели као што је систем ко-културе хепатоцита-HSC-имуних ћелија у комбинацији са активацијом каспазе и фрагментацијом ДНК, као и механизам деловања, укључујући ниво протеина, требало размотрити како би се проучила улога IPA и њена интеракција са другим типовима ћелија јетре.