Хвала вам што сте посетили nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо да користите најновију верзију прегледача (или да искључите режим компатибилности у Internet Explorer-у). Поред тога, како би се осигурала континуирана подршка, ова страница неће садржати стилове или JavaScript.
Водоник сулфид (H2S) има вишеструке физиолошке и патолошке ефекте на људски организам. Натријум хидросулфид (NaHS) се широко користи као фармаколошко средство за процену ефеката H2S у биолошким експериментима. Иако губитак H2S из раствора NaHS траје само неколико минута, раствори NaHS су коришћени као донорска једињења за H2S у води за пиће у неким студијама на животињама. Ова студија је испитивала да ли вода за пиће са концентрацијом NaHS од 30 μM, припремљена у боцама за пацове/мишеве, може остати стабилна најмање 12–24 сата, како сугеришу неки аутори. Припремите раствор NaHS (30 μM) у води за пиће и одмах га сипајте у боце за воду за пацове/мишеве. Узорци су сакупљени са врха и унутрашњости боце за воду на 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 и 24 сата да би се измерио садржај сулфида коришћењем методе метилен плавог. Поред тога, мужјацима и женкама пацова је убризган NaHS (30 μM) током две недеље, а концентрације сулфида у серуму су мерене сваког другог дана током прве недеље и на крају друге недеље. Раствор NaHS у узорку добијеном са врха флаше за воду био је нестабилан; смањио се за 72% и 75% након 12 и 24 сата, респективно. У узорцима добијеним из унутрашњости флаша за воду, смањење NaHS није било значајно у року од 2 сата; међутим, смањило се за 47% и 72% након 12 и 24 сата, респективно. Ињекција NaHS није утицала на ниво сулфида у серуму код мужјака и женки пацова. Закључно, раствори NaHS припремљени од воде за пиће не би требало да се користе за донацију H2S јер је раствор нестабилан. Овај начин примене ће изложити животиње неправилним и мањим количинама NaHS од очекиваних.
Водоник сулфид (H2S) се користи као токсин од 1700. године; међутим, његову могућу улогу као ендогеног биосигналног молекула описали су Абе и Кимура 1996. године. Током протекле три деценије, разјашњене су бројне функције H2S у различитим људским системима, што је довело до схватања да молекули донори H2S могу имати клиничку примену у лечењу или управљању одређеним болестима; видети Чирино и др. за недавни преглед.
Натријум хидросулфид (NaHS) се широко користи као фармаколошко средство за процену ефеката H2S у многим студијама на ћелијским културама и животињама5,6,7,8. Међутим, NaHS није идеалан донор H2S јер се брзо претвара у H2S/HS- у раствору, лако се контаминира полисулфидима и лако оксидује и испарава4,9. У многим биолошким експериментима, NaHS се раствара у води, што резултира пасивним испаравањем и губитком H2S10,11,12, спонтаном оксидацијом H2S11,12,13 и фотолизом14. Сулфид у оригиналном раствору се губи веома брзо због испаравања H2S11. У отвореном контејнеру, време полураспада (t1/2) H2S је око 5 минута, а његова концентрација се смањује за око 13% у минути10. Иако губитак водоник-сулфида из раствора NaHS траје само неколико минута, неке студије на животињама су користиле растворе NaHS као извор водоник-сулфида у води за пиће током 1–21 недеље, замењујући раствор који садржи NaHS сваких 12–24 сата.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Ова пракса није у складу са принципима научног истраживања, јер дозе лекова треба да се заснивају на њиховој употреби код других врста, посебно код људи.27
Преклиничка истраживања у биомедицини имају за циљ побољшање квалитета неге пацијената или исхода лечења. Међутим, резултати већине студија на животињама још увек нису примењени на људе28,29,30. Један од разлога за овај транслациони неуспех је недостатак пажње посвећене методолошком квалитету студија на животињама30. Стога је циљ ове студије био да се истражи да ли раствори NaHS од 30 μM припремљени у боцама за воду за пацове/мишеве могу остати стабилни у води за пиће током 12–24 сата, како се тврди или сугерише у неким студијама.
Сви експерименти у овој студији спроведени су у складу са објављеним смерницама за негу и коришћење лабораторијских животиња у Ирану31. Сви експериментални извештаји у овој студији такође су пратили смернице ARRIVE32. Етички комитет Института за ендокрине науке, Универзитета медицинских наука Шахид Бехешти, одобрио је све експерименталне процедуре у овој студији.
Цинк ацетат дихидрат (CAS: 5970-45-6) и безводни гвожђе(III) хлорид (CAS: 7705-08-0) су купљени од Biochem, Chemopahrama (Косне сир Лоар, Француска). Натријум хидросулфид хидрат (CAS: 207683-19-0) и N,N-диметил-п-фенилендиамин (DMPD) (CAS: 535-47-0) су купљени од Sigma-Aldrich (Сент Луис, Мисури, САД). Изофлуран је купљен од Piramal (Бетлехем, Пенсилванија, САД). Хлороводонична киселина (HCl) је купљена од Merck (Дармштат, Немачка).
Припремите раствор NaHS (30 μM) у води за пиће и одмах га сипајте у боце за воду за пацове/мишеве. Ова концентрација је изабрана на основу бројних публикација које користе NaHS као извор H2S; видети одељак Дискусија. NaHS је хидратисани молекул који може да садржи различите количине хидратационе воде (тј. NaHS•xH2O); према произвођачу, проценат NaHS коришћеног у нашој студији био је 70,7% (тј. NaHS•1,3 H2O), и ми смо ову вредност узели у обзир у нашим прорачунима, где смо користили молекулску тежину од 56,06 г/мол, што је молекулска тежина безводног NaHS. Хидратациона вода (такође названа вода кристализације) су молекули воде који чине кристалну структуру33. Хидрати имају различита физичка и термодинамичка својства у поређењу са анхидратима34.
Пре додавања NaHS у воду за пиће, измерите pH и температуру растварача. Одмах сипајте раствор NaHS у боцу за воду за пацове/мишеве у кавезу за животиње. Узорци су сакупљени са врха и из унутрашњости боце за воду на 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 и 24 сата да би се измерио садржај сулфида. Мерења сулфида су вршена одмах након сваког узорковања. Узорке смо добили са врха епрувете јер су неке студије показале да мала величина пора цеви за воду може минимизирати испаравање H2S15,19. Чини се да се овај проблем односи и на раствор у боци. Међутим, то није био случај са раствором у грлићу боце за воду, који је имао већу брзину испаравања и био је аутооксидишући; у ствари, животиње су прво пиле ову воду.
У студији су коришћени мужјаци и женке Вистар пацова. Пацови су смештени у полипропиленске кавезе (2–3 пацова по кавезу) под стандардним условима (температура 21–26 °C, влажност 32–40%) са 12 сати светлости (од 7 до 19 часова) и 12 сати таме (од 19 до 7 часова). Пацови су имали слободан приступ води из славине и храњени су стандардном храном (Khorak Dam Pars Company, Техеран, Иран). Женке (n=10, телесна тежина: 190–230 г) и мужјаци (n=10, телесна тежина: 320–370 г) Вистар пацова, усклађених по старости (6 месеци), насумично су подељени у контролне и групе третиране NaHS (30 μM) (n=5 по групи). Да бисмо одредили величину узорка, користили смо KISS (Keep It Simple, Stupid) приступ, који комбинује претходно искуство и анализу снаге35. Прво смо спровели пилот студију на 3 пацова и одредили средњи ниво укупног сулфида у серуму и стандардну девијацију (8,1 ± 0,81 μM). Затим, узимајући у обзир снагу од 80% и претпостављајући двострани ниво значајности од 5%, одредили смо прелиминарну величину узорка (n = 5 на основу претходне литературе) која је одговарала стандардизованој величини ефекта од 2,02 са унапред дефинисаном вредношћу коју је предложио Фестинг за израчунавање величине узорка експерименталних животиња35. Након множења ове вредности са стандардном девијацијом (2,02 × 0,81), предвиђена величина детектабилног ефекта (1,6 μM) била је 20%, што је прихватљиво. То значи да је n = 5/група довољна да се детектује средња промена од 20% између група. Пацови су насумично подељени у контролне и групе третиране NaSH користећи функцију случајности у Excel софтверу36 (Допунска слика 1). Заслепљивање је извршено на нивоу исхода, а истраживачи који су вршили биохемијска мерења нису били упознати са распоређивањем група.
Групе оба пола које су примале NaHS третиране су раствором NaHS од 30 μM припремљеним у води за пиће током 2 недеље; Свеж раствор је давао сваких 24 сата, током којих је мерена телесна тежина. Узорци крви су сакупљани са врхова репова свих пацова под изофлуранском анестезијом сваког другог дана на крају прве и друге недеље. Узорци крви су центрифугирани на 3000 g током 10 минута, серум је одвојен и чуван на –80°C за накнадно мерење урее у серуму, креатинина (Cr) и укупног сулфида. Уреа у серуму је одређена ензимском уреазном методом, а креатинин у серуму је одређен фотометријском Јафе методом коришћењем комерцијално доступних комплета (Man Company, Техеран, Иран) и аутоматског анализатора (Selectra E, серијски број 0-2124, Холандија). Интра- и интер-аналитички коефицијенти варијације за уреу и Cr били су мањи од 2,5%.
Метода метилен плавог (MB) се користи за мерење укупног сулфида у води за пиће и серуму који садржи NaHS; MB је најчешће коришћена метода за мерење сулфида у расутим растворима и биолошким узорцима11,37. MB метода се може користити за процену укупног базена сулфида38 и мерење неорганских сулфида у облику H2S, HS- и S2 у воденој фази39. У овој методи, сумпор се таложи као цинк сулфид (ZnS) у присуству цинк ацетата11,38. Таложење цинк ацетата је најчешће коришћена метода за одвајање сулфида од других хромофора11. ZnS је поново растворен помоћу HCl11 под јако киселим условима. Сулфид реагује са DMPD у стехиометријском односу 1:2 у реакцији катализованој гвожђе(III) хлоридом (Fe3+ делује као оксидационо средство) да би се формирала боја MB, која се спектрофотометријски детектује на 670 nm40,41. Граница детекције MB методе је приближно 1 μM11.
У овој студији, 100 μL сваког узорка (раствора или серума) је додато у епрувету; затим је додато 200 μL цинк ацетата (1% w/v у дестилованој води), 100 μL DMPD (20 mM у 7,2 M HCl) и 133 μL FeCl3 (30 mM у 1,2 M HCl). Смеша је инкубирана на 37°C у мраку током 30 минута. Раствор је центрифугиран на 10.000 g током 10 минута, а апсорбанција супернатанта је очитана на 670 nm помоћу читача микроплоча (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, САД). Концентрације сулфида су одређене коришћењем калибрационе криве NaHS (0–100 μM) у ddH2O (Допунска слика 2). Сви раствори коришћени за мерења су свеже припремљени. Коефицијенти варијације интра- и интер-анализа за мерења сулфида били су 2,8% и 3,4%, респективно. Такође смо одредили укупни сулфид опорављен из узорака воде за пиће и серума који садрже натријум тиосулфат користећи методу обогаћеног узорка42. Опоравак за узорке воде за пиће и серума који садрже натријум тиосулфат био је 91 ± 1,1% (n = 6) и 93 ± 2,4% (n = 6), респективно.
Статистичка анализа је спроведена коришћењем софтвера GraphPad Prism верзије 8.0.2 за Windows (GraphPad Software, Сан Дијего, Калифорнија, САД, www.graphpad.com). За поређење температуре и pH вредности воде за пиће пре и после додавања NaHS коришћен је упарени t-тест. Губитак H2S у раствору који садржи NaHS израчунат је као процентуално смањење у односу на почетну вредност апсорпције, а да бисмо проценили да ли је губитак статистички значајан, извршили смо једносмерну ANOVA са поновљеним мерењима, а затим Дунетов тест вишеструког поређења. Телесна тежина, серумска уреа, серумски креатинин и укупни серумски сулфид током времена упоређени су између контролних и пацова третираних NaHS различитог пола коришћењем двосмерне мешовите (између-унутар) ANOVA, а затим Бонферонијевог пост хок теста. Двостране P вредности < 0,05 сматране су статистички значајним.
pH вредност воде за пиће била је 7,60 ± 0,01 пре додавања NaHS и 7,71 ± 0,03 након додавања NaHS (n = 13, p = 0,0029). Температура воде за пиће била је 26,5 ± 0,2 и смањила се на 26,2 ± 0,2 након додавања NaHS (n = 13, p = 0,0128). Припремити раствор NaHS од 30 μM у води за пиће и чувати га у боци за воду. Раствор NaHS је нестабилан и његова концентрација се временом смањује. Приликом узорковања са грла боце за воду, примећено је значајно смањење (68,0%) у првом сату, а садржај NaHS у раствору се смањио за 72% и 75% након 12 и 24 сата, респективно. У узорцима добијеним из боца за воду, смањење NaHS није било значајно до 2 сата, али се након 12 и 24 сата смањило за 47% и 72%, респективно. Ови подаци указују да је проценат NaHS у раствору од 30 μM припремљеном у води за пиће смањен на приближно једну четвртину почетне вредности након 24 сата, без обзира на локацију узорковања (Слика 1).
Стабилност раствора NaHS (30 μM) у води за пиће у бочицама за пацове/мишеве. Након припреме раствора, узорци су узети са врха и унутрашњости боце за воду. Подаци су приказани као средња вредност ± SD (n = 6/група). * и #, P < 0,05 у поређењу са временом 0. Фотографија боце за воду приказује врх (са отвором) и тело боце. Запремина врха је приближно 740 μL.
Концентрација NaHS у свеже припремљеном раствору од 30 μM била је 30,3 ± 0,4 μM (опсег: 28,7–31,9 μM, n = 12). Међутим, након 24 сата, концентрација NaHS се смањила на нижу вредност (просечна вредност: 3,0 ± 0,6 μM). Као што је приказано на слици 2, концентрације NaHS којима су пацови били изложени нису биле константне током периода истраживања.
Телесна тежина женки пацова значајно се повећавала током времена (са 205,2 ± 5,2 г на 213,8 ​​± 7,0 г у контролној групи и са 204,0 ± 8,6 г на 211,8 ± 7,5 г у групи третираној NaHS); међутим, третман NaHS није имао утицаја на телесну тежину (Сл. 3). Телесна тежина мужјака пацова значајно се повећавала током времена (са 338,6 ± 8,3 г на 352,4 ± 6,0 г у контролној групи и са 352,4 ± 5,9 г на 363,2 ± 4,3 г у групи третираној NaHS); међутим, третман NaHS није имао утицаја на телесну тежину (Сл. 3).
Промене телесне тежине код женских и мужјака пацова након примене NaHS (30 μM). Подаци су приказани као средња вредност ± SEM и упоређени су коришћењем двосмерне мешовите (унутар-између) анализе варијансе са Bonferroni post hoc тестом. n = 5 сваког пола у свакој групи.
Концентрације урее и креатин фосфата у серуму биле су упоредиве код контролних и пацова третираних NaSH током целе студије. Штавише, третман NaSH није утицао на концентрације урее и креатинхрома у серуму (Табела 1).
Почетне концентрације укупног сулфида у серуму биле су упоредиве између контролних и мужјака (8,1 ± 0,5 μM наспрам 9,3 ± 0,2 μM) и женки (9,1 ± 1,0 μM наспрам 6,1 ± 1,1 μM) пацова третираних NaHS. Примена NaHS током 14 дана није имала утицаја на нивое укупног сулфида у серуму ни код мужјака ни код женки пацова (Слика 4).
Промене концентрације укупног сулфида у серуму код мужјака и женки пацова након примене NaHS (30 μM). Подаци су представљени као средња вредност ± SEM и упоређени су коришћењем двосмерне мешовите (унутар-унутар) анализе варијансе са Bonferroni post hoc тестом. Сваки пол, n = 5/група.
Главни закључак ове студије је да је вода за пиће која садржи NaHS нестабилна: само око четвртине почетног укупног садржаја сулфида може се детектовати 24 сата након узорковања са врха и унутрашњости боца за воду за пацове/мишеве. Штавише, пацови су били изложени нестабилним концентрацијама NaHS због губитка H2S у раствору NaHS, а додавање NaHS у воду за пиће није утицало на телесну тежину, серумску уреу и креатин хром, нити на укупни серумски сулфид.
У овој студији, брзина губитка H2S из раствора NaHS концентрације 30 μM припремљених у води за пиће била је приближно 3% на сат. У пуферованом раствору (100 μM натријум сулфида у 10 mM PBS, pH 7,4), пријављено је да се концентрација сулфида смањује за 7% током времена током 8 сати11. Раније смо бранили интраперитонеалну примену NaHS извештавајући да је брзина губитка сулфида из раствора NaHS концентрације 54 μM у води за пиће била приближно 2,3% на сат (4%/сат у првих 12 сати и 1,4%/сат у последњих 12 сати након припреме)8. Раније студије43 су пронашле константан губитак H2S из раствора NaHS, првенствено због испаравања и оксидације. Чак и без додавања мехурића, сулфид у основном раствору се брзо губи због испаравања H2S11. Студије су показале да се током процеса разблаживања, који траје око 30–60 секунди, око 5–10% H2S губи због испаравања6. Да би се спречило испаравање H2S из раствора, истраживачи су предузели неколико мера, укључујући благо мешање раствора12, покривање основног раствора пластичном фолијом6 и минимизирање излагања раствора ваздуху, јер брзина испаравања H2S зависи од границе ваздух-течност.13 Спонтана оксидација H2S се јавља углавном због јона прелазних метала, посебно гвожђа (III), који су нечистоће у води.13 Оксидација H2S доводи до стварања полисулфида (атома сумпора повезаних ковалентним везама)11. Да би се избегла његова оксидација, раствори који садрже H2S се припремају у деоксигенованим растварачима44,45, а затим се прочишћавају аргоном или азотом 20–30 минута како би се осигурала деоксигенација.11,12,37,44,45,46 Диетилентриаминпентасирћетна киселина (DTPA) је хелатор метала (10–4 M) који спречава аутооксидацију HS у аеробним растворима. У одсуству DTPA, брзина аутооксидације HS- је приближно 50% током приближно 3 сата на 25°C37,47. Штавише, пошто је оксидација 1e-сулфида катализована ултраљубичастим светлом, раствор треба чувати на леду и заштитити од светлости11.
Као што је приказано на слици 5, NaHS се дисоцира на Na+ и HS-6 када се раствори у води; ова дисоцијација је одређена pK1 реакције, која зависи од температуре: pK1 = 3,122 + 1132/T, где се T креће од 5 до 30°C и мери се у степенима Келвина (K), K = °C + 273,1548. HS- има висок pK2 (pK2 = 19), тако да се при pH < 96,49, S2- не формира или се формира у веома малим количинама. Насупрот томе, HS- делује као база и прихвата H+ из молекула H2O, а H2O делује као киселина и претвара се у H2S и OH-.
Формирање раствореног гаса H2S у раствору NaHS (30 µM). aq, водени раствор; g, гас; l, течност. Сви прорачуни претпостављају да је pH воде = 7,0 и температура воде = 20 °C. Креирано помоћу BioRender.com.
Упркос доказима да су раствори NaHS нестабилни, неколико студија на животињама је користило растворе NaHS у води за пиће као донор H2S једињења15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 са трајањем интервенције од 1 до 21 недеље (Табела 2). Током ових студија, раствор NaHS је обнављан сваких 12 сати, 15, 17, 18, 24, 25 сати или 24 сата, 19, 20, 21, 22, 23 сата. Наши резултати су показали да су пацови били изложени нестабилним концентрацијама лека због губитка H2S из раствора NaHS, а садржај NaHS у води за пиће пацова је значајно флуктуирао током 12 или 24 сата (видети Слику 2). Две од ових студија су показале да су нивои H2S у води остали стабилни током 24 сата22 или да је примећен само губитак H2S од 2–3% током 12 сати15, али нису пружиле пратеће податке или детаље мерења. Две студије су показале да мали пречник боца за воду може минимизирати испаравање H2S15,19. Међутим, наши резултати су показали да ово може одложити губитак H2S из боце за воду само за 2 сата уместо за 12–24 сата. Обе студије напомињу да претпостављамо да се ниво NaHS у води за пиће није променио јер нисмо приметили промену боје воде; стога, оксидација H2S ваздухом није била значајна19,20. Изненађујуће, ова субјективна метода процењује стабилност NaHS у води, а не мери промену његове концентрације током времена.
Губитак H2S у раствору NaHS повезан је са pH вредношћу и температуром. Као што је наведено у нашој студији, растварање NaHS у води доводи до стварања алкалног раствора50. Када се NaHS раствори у води, стварање раствореног гаса H2S зависи од pH вредности6. Што је pH вредност раствора нижа, већи је удео NaHS присутног као молекула гаса H2S и више сулфида се губи из воденог раствора11. Ниједна од ових студија није известила о pH вредности воде за пиће која се користи као растварач за NaHS. Према препорукама СЗО, које усваја већина земаља, pH вредност воде за пиће треба да буде у опсегу 6,5–8,551. У овом pH опсегу, брзина спонтане оксидације H2S се повећава приближно десет пута13. Растварање NaHS у води у овом pH опсегу резултираће концентрацијом раствореног гаса H2S од 1 до 22,5 μM, што наглашава важност праћења pH вредности воде пре растварања NaHS. Поред тога, температурни опсег пријављен у горе наведеној студији (18–26 °C) резултирао би променом концентрације раствореног H2S гаса у раствору од приближно 10%, јер промене температуре мењају pK1, а мале промене pK1 могу имати значајан утицај на концентрацију раствореног H2S гаса48. Поред тога, дуго трајање неких студија (5 месеци)22, током којих се очекује велика варијабилност температуре, такође погоршава овај проблем.
Све студије осим једне21 користиле су раствор NaHS од 30 μM у води за пиће. Да би објаснили коришћену дозу (тј. 30 μM), неки аутори су истакли да NaHS у воденој фази производи потпуно исту концентрацију гаса H2S и да је физиолошки опсег H2S од 10 до 100 μM, тако да је ова доза унутар физиолошког опсега15,16. Други су објаснили да 30 μM NaHS може одржати ниво H2S у плазми унутар физиолошког опсега, тј. 5–300 μM19,20. Узимамо у обзир концентрацију NaHS у води од 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), која је коришћена у неким студијама за проучавање ефеката H2S. Можемо израчунати да је концентрација раствореног гаса H2S 14,7 μM, што је око 50% почетне концентрације NaHS. Ова вредност је слична вредности коју су израчунали други аутори под истим условима13,48.
У нашој студији, примена NaHS није променила телесну тежину; овај резултат је у складу са резултатима других студија на мужјацима мишева22,23 и мужјацима пацова18; Међутим, две студије су показале да је NaSH обновио смањену телесну тежину код нефректомисаних пацова24,26, док друге студије нису пријавиле ефекат примене NaSH на телесну тежину15,16,17,19,20,21,25. Штавише, у нашој студији, примена NaSH није утицала на нивое урее и креатин-хрома у серуму, што је у складу са резултатима другог извештаја25.
Студија је открила да додавање NaHS у воду за пиће током 2 недеље није утицало на укупне концентрације сулфида у серуму код мужјака и женки пацова. Овај налаз је у складу са резултатима Сена и др. (16): 8 недеља третмана са 30 μM NaHS у води за пиће није утицало на нивое сулфида у плазми код контролних пацова; међутим, известили су да је ова интервенција обновила смањене нивое H2S у плазми нефректомисаних мишева. Ли и др. (22) су такође известили да је третман са 30 μM NaHS у води за пиће током 5 месеци повећао нивое слободног сулфида у плазми код старијих мишева за око 26%. Друге студије нису известиле о променама у циркулишућем сулфиду након додавања NaHS у воду за пиће.
Седам студија је објавило коришћење Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, али нису пружиле додатне детаље о хидратационој води, а пет студија није поменуло извор NaHS коришћеног у њиховим методама припреме17,18,24,25,26. NaHS је хидратисани молекул и његов садржај хидратационе воде може да варира, што утиче на количину NaHS потребну за припрему раствора дате моларности. На пример, садржај NaHS у нашој студији био је NaHS•1,3 H2O. Стога, стварне концентрације NaHS у овим студијама могу бити ниже од оних које су пријављене.
„Како тако краткотрајно једињење може имати тако дуготрајан ефекат?“ Позгај и др.21 поставили су ово питање када су процењивали ефекте NaHS на колитис код мишева. Они се надају да ће будуће студије моћи да одговоре на ово питање и спекулишу да раствори NaHS могу да садрже стабилније полисулфиде поред H2S и дисулфида који посредују у ефекту NaHS21. Друга могућност је да веома ниске концентрације NaHS које остају у раствору такође могу имати благотворан ефекат. У ствари, Олсон и др. су пружили доказе да микромоларни нивои H2S у крви нису физиолошки и да би требало да буду у наномоларном опсегу или потпуно одсутни13. H2S може деловати путем сулфације протеина, реверзибилне посттранслационе модификације која утиче на функцију, стабилност и локализацију многих протеина52,53,54. У ствари, под физиолошким условима, приближно 10% до 25% многих протеина јетре је сулфилисано53. Обе студије признају брзо уништавање NaHS19,23 али изненађујуће наводе да смо „контролисали концентрацију NaHS у води за пиће тако што смо га свакодневно замењивали“.23 Једна студија је случајно навела да је „NaHS стандардни донор H2S и да се често користи у клиничкој пракси за замену самог H2S“.18
Горе наведена дискусија показује да се NaHS губи из раствора кроз испаравање, оксидацију и фотолизу, и стога су дати неки предлози за смањење губитка H2S из раствора. Прво, испаравање H2S зависи од границе гаса и течности13 и pH вредности раствора11; стога, да би се минимизирао губитак испаравањем, грлић боце за воду може бити што мањи, као што је претходно описано15,19, а pH вредност воде може се подесити на прихватљиву горњу границу (тј. 6,5–8,551) како би се минимизирао губитак испаравањем11. Друго, спонтана оксидација H2S настаје због дејства кисеоника и присуства јона прелазних метала у води за пиће13, тако да деоксигенација воде за пиће аргоном или азотом44,45 и употреба хелатора метала37,47 могу смањити оксидацију сулфида. Треће, да би се спречила фоторазградња H2S, боце за воду могу се обмотати алуминијумском фолијом; Ова пракса се такође примењује на материјале осетљиве на светлост, као што је стрептозотоцин55. Коначно, неорганске сулфидне соли (NaHS, Na2S и CaS) могу се примењивати путем сонде уместо растворене у води за пиће као што је раније објављено56,57,58; студије су показале да се радиоактивни натријум сулфид који се примењује путем сонде пацовима добро апсорбује и дистрибуира у готово сва ткива59. До данас, већина студија је примењивала неорганске сулфидне соли интраперитонеално; међутим, овај пут се ретко користи у клиничким условима60. С друге стране, орални пут је најчешћи и најпожељнији пут примене код људи61. Стога препоручујемо процену ефеката донора H2S код глодара оралном сондом.
Ограничење је то што смо мерили сулфид у воденом раствору и серуму користећи МБ методу. Методе за мерење сулфида укључују титрацију јода, спектрофотометрију, електрохемијску методу (потенциометрија, амперометрија, кулометријска метода и амперометријска метода) и хроматографију (гасна хроматографија и високоефикасна течна хроматографија), међу којима је најчешће коришћена МБ спектрофотометријска метода62. Ограничење МБ методе за мерење H2S у биолошким узорцима је то што мери сва једињења која садрже сумпор, а не слободни H2S63, јер се изводи у киселим условима, што резултира екстракцијом сумпора из биолошког извора64. Међутим, према Америчком удружењу за јавно здравље, МБ је стандардна метода за мерење сулфида у води65. Стога, ово ограничење не утиче на наше главне резултате о нестабилности раствора који садрже NaHS. Штавише, у нашој студији, опоравак мерења сулфида у узорцима воде и серума који садрже NaHS био је 91% и 93%, респективно. Ове вредности су у складу са претходно објављеним распонима (77–92)66, што указује на прихватљиву аналитичку прецизност42. Вреди напоменути да смо користили и мужјаке и женке пацова у складу са смерницама Националног института за здравље (NIH) како бисмо избегли претерано ослањање на студије на животињама само на мужјацима у претклиничким студијама67 и како бисмо укључили и мужјаке и женке пацова кад год је то могуће68. Ову тачку су истицали и други69,70,71.
Закључно, резултати ове студије указују да се раствори NaHS припремљени од воде за пиће не могу користити за генерисање H2S због њихове нестабилности. Овај начин примене би изложио животиње нестабилним и нижим од очекиваних нивоа NaHS; стога се налази можда не могу применити на људе.
Скупови података коришћени и/или анализирани током текуће студије доступни су од одговарајућег аутора на разуман захтев.
Сабо, К. Хронологија истраживања водоник-сулфида (H2S): од еколошког токсина до биолошког медијатора. Биохемија и фармакологија 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Абе, К. и Кимура, Х. Могућа улога водоник-сулфида као ендогеног неуромодулатора. Часопис за неуросциенце, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Чирино, Г., Сабо, К. и Папапетропулос, А. Физиолошка улога водоник-сулфида у ћелијама, ткивима и органима сисара. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Дилон, К.М., Каразон, Р.Ј., Матсон, Џ.Б. и Кашфи, К. Еволуција обећања система за ћелијску испоруку азот-оксида и водоник-сулфида: нова ера персонализоване медицине. Биохемија и фармакологија 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Сун, X. и др. Дуготрајна примена донора водоник-сулфида са спорим ослобађањем може спречити исхемију/реперфузионо оштећење миокарда. Научни извештаји 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Ситдикова, ГФ, Фукс, Р., Кајнц, В., Вајгер, ТМ и Херман, А. Фосфорилација БК канала регулише осетљивост на водоник сулфид (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Ситдикова, ГФ, Вајгер, ТМ и Херман, А. Водоник сулфид појачава активност калијумових (BK) канала активираних калцијумом у ћелијама тумора хипофизе пацова. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Џеди, С. и др. Водоник сулфид појачава заштитни ефекат нитрита против оштећења миокарда изазваног исхемијом-реперфузијом код пацова са дијабетесом типа 2. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Корвино, А. и др. Трендови у хемији донора H2S и њен утицај на кардиоваскуларне болести. Антиоксиданси 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
ДеЛеон, ЕР, Стој, ГФ и Олсон, КР (2012). Пасивни губици водоник-сулфида у биолошким експериментима. Аналитичка биохемија 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Нађ, П. и др. Хемијски аспекти мерења водоник-сулфида у физиолошким узорцима. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Клајн, доктор права. Спектрофотометријско одређивање водоник-сулфида у природним водама. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Олсон, КР (2012). Практична обука из хемије и биологије водоник-сулфида. „Антиоксиданти.“ Редокс сигнализација. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).