Сортирање протеина у секреторном путу је неопходно за одржавање компартментализације ћелија и хомеостазе. Поред сортирања посредованог љуском, улога липида у сортирању кинезина у процесу секреторног транспорта је дугогодишње основно питање на које још увек није одговорено. Овде вршимо 3Д симултано вишебојно снимање високе резолуције у реалном времену како бисмо in vivo доказали да су новосинтетизовани протеини имобилизовани гликозилфосфатидилинозитолом са веома дугим керамидним липидним деловима груписани и класификовани у специјализована места излаза ендоплазматске мреже, која се разликују од оних које користе трансмембрански протеини. Поред тога, показујемо да је дужина ланца керамида у мембрани ендоплазматског ретикулума критична за ову селективност сортирања. Наша студија пружа прве директне in vivo доказе за класификацију протеинских терета на основу дужине липидног ланца у селективна места извоза у секреторном путу.
У еукариотским ћелијама, протеини синтетизовани у ендоплазматском ретикулуму (ЕР) се затим сортирају током транспорта кроз секреторни пут ради испоруке до одговарајуће ћелијске дестинације (1). Поред сортирања посредованог омотачем, дуго се спекулисало да одређени липиди могу служити и као селективне излазне тачке груписањем у специфичне мембранске домене који су специфични за протеине (2-5). Међутим, још увек недостају директни in vivo докази који би доказали овај могући механизам заснован на липидима. Да бисмо решили овај основни проблем, проучавали смо код квасца како се протеини усидрени гликозилфосфатидилинозитолом (GPI) (GPI-AP) диференцијално извозе из ЕР. GPI-AP су разноврсни протеини ћелијске површине повезани са липидима (6, 7). GPI-AP је секретовани протеин везан за спољашње листиће плазма мембране преко гликолипидног дела (GPI сидро). Они прихватају GPI сидра као конзервативне посттранслационе модификације у лумену ЕР (8). Након везивања, GPI-AP пролази кроз Голџијев апарат (5, 9) од ендоплазматског ретикулума до плазма мембране. Присуство GPI сидара узрокује да се GPI-AP транспортује одвојено од трансмембрански секретованих протеина (укључујући и друге протеине плазма мембране) дуж секреторног пута (5, 9, 10). У ћелијама квасца, GPI-AP се одвајају од других секретованих протеина у ендоплазматском ретикулуму, а затим пакују у јединствене везикуле обмотане комплексом протеина омотача II (COPII) (6, 7). Детерминанте овог процеса класификације у процесу извоза ЕР нису јасне, али се спекулише да овај механизам може захтевати липиде, посебно структурно ремоделирање липидног дела GPI сидра (5, 8). Код квасца, ремоделирање GPI липида почиње одмах након везивања GPI, и у многим случајевима, то узрокује везивање церамида за засићену масну киселину дугог ланца са 26 угљеникових атома (C26:0) (11, 12). C26 церамид је главни церамид који до сада производе ћелије квасца. Синтетише се у ендоплазматском ретикулуму (ЕР) и већи део се извози у Голџијев апарат кроз COPII везикуле (13). Извоз GPI-AP из ЕР захтева континуирану синтезу церамида (14, 15), а заузврат, конверзија церамида у инозитол фосфат церамид (IPC) у Голџијевом апарату зависи од синтезе GPI сидра (16). Биофизичке студије са вештачким мембранама су показале да се церамиди са веома дугим ацилним ланцем могу спојити и формирати уређене домене са јединственим физичким својствима (17, 18). Ови подаци доводе до хипотезе да C26 церамид и GPI-AP са C26 церамидом користе своја физичка својства да се споје у уређене регионе или регионе у релативно неуређеном липидном окружењу мембране ЕР. Углавном је састављен од кратких и незасићених глицеролилипида (C16:1 и C18:1) (19, 20). Ови региони ће бити селективно фокусирани на специфична места изласка из ендоплазматског ретикулума (ERES), где се церамид и GPI-AP на бази церамида могу котранспортовати до Голџијевог апарата у истој наменској COPII везикули (5).
У овој студији, директно смо тестирали овај механизам заснован на липидима користећи супер-резолуциону конфокалну микроскопију за снимање у реалном времену (SCLIM), што је најсавременија техника микроскопије која може истовремено да посматра флуоресцентно обележене протеине. Тробојне и тродимензионалне (3Д) слике имају изузетно високу резолуцију и брзину у живим ћелијама (21, 22).
Прво смо применили SCLIM технологију како бисмо даље дефинисали како је нормални GPI-AP са C26 церамидном групом скриниран од трансмембрански секретованих протеина након напуштања ЕР код S. cerevisiae. Да бисмо проверили класификацију ЕР, користили смо генетски систем који може директно да визуализује новосинтетисани терет који улази у ЕРЕС in vivo (7, 23). Као терет, изабрали смо GPI-AP Gas1 на бази C26 церамида обележен зеленим флуоресцентним протеином (GFP) и трансмембрански секретовани протеин Mid2 обележен блиско-инфрацрвеним флуоресцентним протеином (iRFP), који оба циљају плазма мембрану (24–26). Код температурно осетљивог мутанта sec31-1, ова два терета се експресују под галактозом-индуцибилним промотором и конститутивним ЕРЕС маркером. На екстремној температури (37°C), пошто мутација sec31-1 утиче на функцију COPII компоненте омотача Sec31 да инхибира клијање COPII и извоз ЕР, новосинтетисани терет се акумулира на ЕР (23). Након хлађења на ниску температуру (24°C), мутантне ћелије sec31-1 су се опоравиле из секреторног подручја, а акумулирани нови синтетички терет је почео да се извози из ЕР. CLIM визуелизација је показала да се већина новосинтетисаних Gas1-GFP и Mid2-iRFP и даље акумулирала у ЕР ћелија мутанта sec31-1 након инкубације на 37°C, а затим ослобађала на 24°C током 5 минута (Слика 1). Пошто је Mid2-iRFP дистрибуиран по целој ЕР мембрани, а Gas1-GFP је концентрисан и сакупљен у дисконтинуираном подручју ЕР мембране, њихова дистрибуција је потпуно другачија (Слика 1, А до Ц и Филм S1). Поред тога, као што је приказано на Слици 1D, кластер Gas1-GFP нема Mid2-iRFP. Ови резултати указују на то да су GPI-AP и трансмембрански протеини рано раздвојени у различите регионе ЕР мембране. Кластер Gas1-GFP је поред специфичног ERES-а обележеног mCherry-јевим COPII протеином омотача Sec13 (слика 1, E и F, и филм S1) (23).
Ћелије sec31-1 експресују галактозом индуковане секрете, дуги ацилни ланац (C26) керамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, зелена) и трансмембрански протеин Mid2-iRFP (TMP, плава) и ово конструктивно ERES обележавање Sec13-mCherry (ERES, магента) је инкубирано на 37°C током 30 минута, премештено на 24°C и снимљено SCLIM-ом 5 минута касније. (А до Ц) приказује репрезентативну спојену или једну 2Д слику равни (А), 2Д пројекциону слику 10 z-пресека (Б) или 3Д слику ћелијске хемисфере терета и ERES маркера (Ц). Скала 1μm (А и Б). Јединица скале је 0,551μm (Ц). Gas1-GFP је детектован у дискретним ER регионима или кластерима, док је Mid2-iRFP детектован и дистрибуиран по целој ER мембрани (Ц). (D) График приказује релативни интензитет флуоресценције Gas1-GFP и Mid2-iRFP у кластеру Gas1-GFP дуж беле линије стрелице (лево). AU, произвољна јединица. (E и F) представљају 3D слику која комбинује ознаку добра и ERES. Кластери Gas1-GFP су детектовани у близини специфичног ERES-а. Јединица скале је 0,551μm. (F) Бела пуна стрелица означава кластер Gas1-GFP повезан са ERES-ом. Средњи и десни панел приказују спојену увећану 3D слику и ротирани приказ изабраног кластера Gas1-GFP.
Блиски просторни однос између кластера Gas1-GFP и специфичног ERES-а указује на то да Gas1-GFP може ући у селективни ERES, што се разликује од селективности коју користи Mid2-iRFP да напусти ER. Да бисмо се позабавили овом могућношћу, квантификовали смо ERES однос за само једну или две робе (Слика 2, од А до Ц). Открили смо да већина ERES-а (70%) садржи само једну врсту терета. Доња слика на Слици 2Ц приказује два типична примера ERES-а са само Gas1-GFP (Слика 1) или само Mid2-iRFP (Слика 2). Насупрот томе, приближно 20% ERES-а садржи два терета која се преклапају у истој области. Утврђено је да неки ERES (10%) садрже две врсте терета, али су изоловани у јасно различитим областима. Стога, ова статистичка анализа показује да након што се ER извезе, GPI-AP Gas1-GFP и трансмембрански терет Mid2-iRFP су подељени у различите ERES-ове (Слика 2Д). Ова ефикасност сортирања је веома у складу са претходном биохемијском анализом (6) и морфолошким одређивањем (7). Такође можемо посматрати понашање карантинског терета који улази у ERES (слика 2Е и филм S2). Слика 2Е показује да само мали део Gas1-GFP (панел 3) или Mid2-iRFP (панел 4) улази у ERES са једне стране и ограничен је у дискретном подручју. Панел 5 на слици 2Е показује да се Gas1-GFP и Mid2-iRFP понекад налазе у истом ERES-у, али улазе са различитих страна и концентрисани су у одвојеним регионима који могу представљати различите COPII везикуле. Такође смо потврдили да је уочено раздвајање и класификација GPI-AP Gas1 на бази C26 керамида као селективног ERES-а специфично јер други трансмембрански секреторни терет, GFP-означени протеин плазма мембране Axl2 (27), показује слично понашање као Mid2-iRFP. (слика S1 и филм S3). Новосинтетизовани Axl2-GFP се дистрибуира кроз ER мембрану попут Mid2-iRFP (слике S1, A и B) и колокализован је са Mid2-iRFP у већини ERES-а (слике S1, B до D). Панели 1 и 2 на слици 1. S1C приказује два типична примера ERES-а где се два трансмембранска терета преклапају. У овим случајевима, оба терета улазе у ERES заједно (слика S1E, панел 3 и филм S3).
Ћелије sec31-1 које експресују галактозом индуцибилне секрете, Gas1-GFP (GPI-AP, зелена) и Mid2-iRFP (TMP, плава) и конститутивно ERES обележавање Sec13-mCherry (ERES, магента) су стављене на 37°C. Након инкубације од 30 минута на °C, премештене су на 24 °C да би се ослободио блок секреције и снимљене су помоћу SCLIM након 20 минута. (А до Ц) Репрезентативне 2Д пројекционе слике (А; скала, 1μm) или 3Д слике ћелијске хемисфере (Б и Ц; јединица скале, 0,456μm) терета и 10 z-пресека означених са ERES. Доњи панел у (Б) и панел у (Ц) приказују обрађене слике да би се приказали само предмети присутни у ERES (магента) [Gas1-GFP (сива) и Mid2-iRFP (светлоплава)]. (Ц) Отворена стрелица: ERES носи само један комад терета (1 до 4). Сива стрелица: ERES садржи одвојени терет (5). Бела пуна стрелица: ERES садржи ко-локирани терет. Испод: Одабрани појединачни ERES садржи само Gas1-GFP (1) или Mid2-iRFP (2). Скала, 100 nm. (D) Квантификација фотомикрографије описане у (C). Просечан проценат ERES-а који садржи само један терет (Gas1-GFP или Mid2-iRFP), одвојени терет и преклапајући терет. У три независна експеримента, n=432 у 54 ћелије. Грешка = SD. Двострани неупарени t-тест. *** P = 0,0002. (E) 3D слика одабраног ERES-а карантинског терета означеног са (C). Gas1-GFP (зелено) (3) или Mid2-iRFP (плаво) (4) улази у ERES (магента) са једне стране и ограничен је на малу област унутар ERES-а. Понекад, обе врсте терета улазе у исти ERES (5) са исте стране и ограничене су на изоловану област унутар ERES-а. Скала, 100 nm.
Затим смо тестирали хипотезу да дуголанчани ацилни ланац церамида (C26) присутан у ЕР мембрани покреће специфично груписање и сортирање Gas1 у селективне ERES. У ту сврху, користили смо модификовани сој квасца GhLag1, у коме су две ендогене церамидне синтазе Lag1 и Lac1 замењене са GhLag1 (Lag1 хомологом памука), што је резултирало сојем квасца са ћелијском мембраном церамида краћим од дивљег типа (Слика 3А) (28). Анализа масене спектрометрије (MS) показала је да је код сојева дивљег типа 95% укупног церамида церамид са веома дугим (C26) ланцем, док је код GhLag1 85% церамида веома дугачко (C18 и C16), само 2% церамида церамид са веома дугим (C26) ланцем. Иако су Ц18 и Ц16 церамиди до сада главни церамиди откривени у мембрани GhLag1, MS анализа је такође потврдила да GPI сидро Gas1-GFP експримирано у соју GhLag1 садржи Ц26 церамид, који је упоредив са липидима дивљег типа. Квалитет је исти (Сл. 3А) (26). Стога, то значи да је ензим за ремоделирање церамида Cwh43 високо селективан за Ц26 церамид, као што је приказано на Слици 26, он преференцијално укључује GPI сидро из мале количине Ц26 церамида у соју GhLag1. С2 (29). Ипак, ћелијска мембрана GhLag1 у основи садржи само Ц18-Ц16 церамид, док Gas1-GFP и даље има Ц26 церамид. Ова чињеница чини овај сој идеалним алатом за специфично решавање проблема дужине ацилног ланца мембранског церамида у ЕР. Хипотетичка улога класе и сортирања. Затим смо прво проучавали способност C26 Gas1-GFP да се акумулира у кластерима у GhLag1 са температурно осетљивим мутантним алелом sec31-1 путем конвенционалне флуоресцентне микроскопије, где само дугачак (C18-C16) ланац постоји у церамиду ЕР мембране (Сл. 3). Приметили смо да је у sec31-1 већина Gas1-GFP концентрисана у кластерима, док Gas1-GFP у sec31-1 GhLag1 са дугом (C18-C16) церамидном ЕР мембраном углавном није био груписан и распоређен у целој ЕР мембрани. Прецизније, пошто је груписање на бази церамида C26 уско повезано са специфичним ERES (Слика 1), затим смо истражили да ли овај процес може укључивати и функцију механизма протеина за извоз ЕР. GPI-AP користи посебан COPII систем за извоз ЕР, који је активно регулисан структурним ремоделирањем гликанског дела GPI сидра од стране Ted1 (30, 31). Рекомбинантни GPI-гликан затим препознаје трансмембрански комплекс p24 рецептора за терет, који заузврат селективно регрутује Lst1, што је специфична изоформа главне COPII подјединице за везивање терета Sec24, формирајући GPI-AP-богат COPII везикуле (31-33). Стога смо конструисали двоструки мутант који је комбиновао делецију ових појединачних протеина (компоненте p24 комплекса Emp24, ензима за ремоделирање GPI-гликана Ted1 и специфичне COPII подјединице Lst1) са мутантним сојем sec31-1 и проучавали их. Да ли је могуће формирати Gas1-кластер GFP (Слика 3). Приметили смо да је у sec31-1emp24Δ и sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP углавном негруписан и дистрибуиран по целој ER мембрани, као што је претходно виђено у sec31-1 GhLag1, док је у sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP као sec31-1. Ови резултати указују да поред присуства C26 церамида у ЕР мембрани, кластерисање Gas1-GFP такође захтева везивање за p24 комплекс и не захтева специфично регрутовање Lst1. Затим смо истражили могућност да дужина ланца церамида у ЕР мембрани може регулисати везивање Gas1-GFP за p24. Међутим, открили смо да присуство C18-C16 церамида у мембрани не утиче на GPI-гликане реконструисане p24 комплексом (слике S3 и S4, A и B) или на везивање за GPI-AP и способност извоза GPI-AP. Регрутује COPII подтип Lst1 (слика S4C). Стога, кластерисање зависно од C26 церамида не захтева интеракције протеина са различитим механизмима извоза протеина ЕР, већ подржава алтернативни механизам сортирања вођен дужином липида. Затим смо анализирали да ли је дужина ацилног ланца церамида у ЕР мембрани важна за ефикасну класификацију Gas1-GFP као селективног ERES-а. Пошто Gas1 у соју GhLag1 са кратким ланцем церамида напушта ЕР и улази у плазма мембрану (слика S5), верујемо да ако је сортирање вођено дужином ацилног ланца церамида, Gas1 у соју GhLag1 може бити преусмерен и укрштен. ERES добра са истом мембраном.
(А) Ћелијска мембрана GhLag1 углавном садржи краће C18-C16 церамиде, док GPI сидро Gas1-GFP и даље има исти C26 IPC као ћелије дивљег типа. Горе: анализа дужине ацилног ланца церамида у ћелијској мембрани сојева дивљег типа (Wt) и GhLag1p помоћу масене спектрометрије (MS). Подаци представљају проценат укупног церамида. Просек три независна експеримента. Грешка = SD. Двострани непарни t-тест. **** P <0,0001. Доњи панел: MS анализа дужине ацилног ланца IPC присутног у GPI сидру Gas1-GFP (GPI-IPC) експримираном у сојевима дивљег типа и GhLag1p. Подаци представљају проценат укупног IPC сигнала. Просек пет независних експеримената. Грешка = SD. Двострани непарни t-тест. ns, није важно. P = 0,9134. (Б) Флуоресцентне микрографије ћелија sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ и sec31-1lst1Δ које експримирају галактозом индуковани Gas1-GFP инкубиране су на 37°C током 30 минута и прослеђене на рутинску флуоресцентну микроскопију након 24°C. Бела стрелица: ER Gas1-GFP кластер. Отворена стрелица: Негруписани Gas1-GFP је распоређен по целој ER мембрани, показујући карактеристично бојење нуклеарног прстена за ER. Скала, 5μm. (Ц) Квантификација фотомикрографије описане у (Б). Просечан проценат ћелија са тачкастом Gas1-GFP структуром. У три независна експеримента, n≥300 ћелија. Грешка = SD. Двострани неупарени t тест. **** P <0,0001.
Да бисмо директно решили овај проблем, извршили смо SCLIM визуелизацију Gas1-GFP и Mid2-iRFP у GhLag1 са температурно осетљивим мутантним алелом sec31-1 (слика 4 и филм S4). Након што је ER задржан на 37°C, а потом ослобођен на 24°C, већина новосинтетисаног Gas1-GFP није била груписана и распоређена по целој ER мембрани, као што је примећено конвенционалним микроскопима (слика 4, А и Б). Поред тога, велики проценат ERES-а (67%) укључује две врсте терета које се налазе у њему (слика 4D). Панели 1 и 2 на слици 4C приказују два типична примера ERES-а са преклапајућим Gas1-GFP и Mid2-GFP. Поред тога, оба терета су регрутована у исти ERES (слика 4E, панел 3 и филм S4). Стога, наши резултати указују да је дужина церамидног ацилног ланца у ER мембрани важан фактор агрегације и класификације ER протеина.
Sec31-1 GhLag1 ћелије које експресују секрете индуковане галактозом, Gas1-GFP (GPI-AP, зелена) и Mid2-iRFP (TMP, плава) и конститутивни ERES-обележени Sec13-mCherry (ERES, магента) Инкубирају се на 37°C. Настављају се 30 минута, спуштају се на 24°C да би се ослободили секрети и слика се помоћу SCLIM након 20 минута. (А до Ц) Репрезентативне 2Д пројекционе слике (А; скала, 1μm) или 3Д слике ћелијских хемисфера (Б и Ц; јединица скале, 0,45μm) 10 z-пресека означених теретом и ERES. Доњи панел у (Б) и панел у (Ц) приказују обрађене слике да би се приказали само производи присутни у ERES (магента) [Gas1-GFP (сива) и Mid2-iRFP (светлоплава)]. (Ц) Бела стрелица: ERES, производи се преклапају. Отворена стрелица: ERES садржи само једну ставку. Доњи панел: Изабрани ERES има преклапајућа добра (1 и 2) означена у (C). Скала, 100 nm. (D) Квантификација фотомикрографије описане у (C). У јединицама sec31-1 и sec31-1 GhLag1, укључен је само један терет (Gas1-GFP или Mid2-iRFP), и просечан проценат ERES-а за изоловани терет и преклапајући терет. У три независна експеримента, n = 432 у 54 ћелије (sec31-1) и n = 430 у 47 ћелија (sec31-1 GhLag1). Грешка = SD. Двострани непарени t-тест. *** P = 0,0002 (sec31-1) и ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D слика изабраног ERES-а са преклапајућим теретом (3) означеним у (C). Gas1-GFP (зелена) и Mid2-iRFP (плава) прилазе ERES-у (магента) са исте стране и остају у истом ограниченом подручју ERES-а. Скала, 100 nm.
Ова студија пружа директне in vivo доказе да се протеински терет на бази липида класификује у селективна места за извоз у секреторном путу и ​​открива значај дужине ацилног ланца за селективност класификације. Користећи моћну и најсавременију технику микроскопије названу SCLIM, демонстрирали смо новосинтетизовани Gas1-GFP (главни GPI-AP плазма мембране са веома дугим делом ацилног ланца (C26) керамидног липида) у квасцу). Региони груписани у дискретним ER-овима повезани су са специфичним ERES-ом, док су трансмембрански секретовани протеини дистрибуирани по целој ER мембрани (Слика 1). Поред тога, ове две врсте робе селективно улазе у различите ERES-ове (Слика 2). Дужина ацилног ланца ћелијског церамида у мембрани је смањена са C26 на C18-C16, Gas1-GFP кластер је прекинут у дискретни ER регион, а Gas1-GFP је преусмерен да напусти ER са трансмембранским протеином кроз исти ERES (Слика 3 и Слика 3). 4).
Иако GPI-AP користи специјализовани протеински механизам за излазак из ER, открили смо да се сепарација зависна од церамида C26 не ослања на диференцијалне протеинске интеракције које могу довести до специјализације ERES-а (слике S4 и S5). Уместо тога, наши налази подржавају алтернативни механизам класификације вођен груписањем протеина заснованих на липидима и накнадним искључивањем других терета. Наша запажања указују да Gas1-GFP региону или кластеру повезаном са специфичним ERES недостаје трансмембрански секретовани протеин Mid2-iRFP, што указује да ће C26 керамид-зависни GPI-AP кластер олакшати њихов улазак у релевантни ERES, а истовремено искључити трансмембранске секрете. Секрети улазе у овај одређени ERES (слике 1 и 2). Насупрот томе, присуство C18-C16 церамида у ER мембрани не узрокује да GPI-AP формира регионе или кластере, тако да они не искључују или не замењују трансмембрански секретоване протеине у истом ERES-у (слике 3 и 4). Стога, предлажемо да Ц26 керамид покреће раздвајање и класификацију олакшавајући груписање протеина повезаних са специфичним ЕРЕС-ом.
Како постићи ово груписање зависно од церамида C26 у специфично подручје ЕР? Тенденција мембранског церамида да се латерално раздваја може довести до тога да GPI-AP и C26 церамид формирају мале и тренутно уређене липиде у неправилнијем липидном окружењу ЕР мембране које садржи краће и незасићене глицероллипиде. Квалитетни кластери (17, 18). Ови мали привремени кластери могу се даље фузирати у веће, стабилније кластере након везивања за p24 комплекс (34). У складу са овим, показали смо да C26 Gas1-GFP треба да интерагује са p24 комплексом да би формирао веће видљиве кластере (Слика 3). p24 комплекс је хетерозиготни олигомер састављен од четири различита трансмембранска протеина p24 у квасцу (35), који обезбеђује мултивалентно везивање, што може довести до умрежавања малих GPI-AP кластера, чиме се генерише већи стабилни кластер (34). Интеракција између протеинских ектодомена GPI-AP такође може допринети њиховој агрегацији, као што је показано током њиховог Голџијевог транспорта у поларизованим епителним ћелијама сисара (36). Међутим, када је C18-C16 церамид присутан у ЕР мембрани, када се p24 комплекс веже за Gas1-GFP, неће се формирати велики одвојени кластери. Основни механизам може зависити од специфичних физичких и хемијских својстава дугог ацил ланца церамида. Биофизичке студије вештачких мембрана показују да иако и дуги (C24) и кратки (C18-C16) ацил ланци церамиди могу изазвати раздвајање фаза, само дуги ацил ланци церамиди (C24) могу промовисати високу закривљеност и савијање филма како би преобликовали филм. Кроз међусобну референцу (17, 37, 38). Показано је да трансмембранска спирала TMED2, људског хомолога Emp24, селективно интерагује са сфингомијелином заснованим на C18 церамиду у цитоплазматским лобулама (39). Користећи симулације молекуларне динамике (МД), открили смо да се и Ц18 и Ц26 церамиди акумулирају око цитоплазматских лобула трансмембранске спирале Emp24 и да имају сличне преференције (слика С6). Вреди напоменути да ово указује на то да трансмембранска спирала Emp24 може довести до асиметричне дистрибуције липида у мембрани. Ово је недавни резултат заснован на ћелијама сисара. Сличне МД симулације такође показују присуство етарских липида (40). Стога претпостављамо да је Ц26 церамид у два лобула ER26 локално обогаћен. Када се GPI-AP у луминалним лобулама директно веже за мултивалентни p24 и акумулација Ц26 церамида око p24 у цитоплазматским лобулама може промовисати пратећу агрегацију протеина и закривљеност мембране која се генерише кроз прсте (41), узрокујући да се GPI-AP раздвоји у дискретне регионе поред ERES-а, што такође фаворизује јако закривљене регионе ER мембране (42). Претходни извештаји су потврдили предложени механизам (43, 44). Мултивалентно везивање олиголектина, патогена или антитела за гликосфинголипиде на бази церамида (GSL) на плазма мембрани покреће велику агрегацију GSL, појачава раздвајање фаза и узрокује деформацију и интернализацију мембране (44). Ивабучи итд. (43) Утврђено је да у присуству дугих (C24), али не и кратких (C16) ацил ланаца, мултивалентни лиганд везан за GSL лактозилцерамид индукује формирање великих кластера и инвагинацију мембране, а цитоплазма Lyn-посредована сигнална трансдукција на листићима је испреплетена ацил ланцима у спрегнутим неутрофилима.
У поларизованим епителним ћелијама сисара, концентрација анти-Голџијеве мреже (TGN) до нивоа апикалне плазма мембране контролише раздвајање и сортирање GPI-AP (10, 45). Ова агрегација је покренута олигомеризацијом GPI-AP (36), али може зависити и од дужине ланца церамида који налазимо у квасцу. Иако GPI-AP сисара има сидро на бази етарских липида, а његова хемијска структура се веома разликује од церамида веома дугог ацилног ланца, недавно истраживање је открило да оба липида имају еволутивно слична физичка и хемијска својства и функцију (40). Стога, део етарских липида у ћелијама сисара може бити сличан церамиду C26 у квасцу, а његова улога је да се повеже са церамидом дугог ланца у мембрани како би се подстакла агрегација и сортирање GPI-AP. Иако ову могућност још увек треба директно тестирати, претходни налази подржавају да се транспорт церамида дугог ацилног ланца до Голџијевог тела не врши цитоплазматским трансфер протеинима, већ зависи од синтезе GPI сидра као код квасца. Стога, чини се да је еволутивни конзервативни механизам способан да селективно котранспортује церамид са веома дугим ацилним ланцем и GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) у истој транспортној везикули.
У системима поларизованих епителних ћелија квасца и сисара, агрегација и одвајање GPI-AP од других протеина плазма мембране се дешавају пре него што достигну површину ћелије. Паладино и др. (48) су открили да на TGN поларизованих епителних ћелија сисара, груписање GPI-AP није неопходно само за селективну класификацију GPI-AP на апикалну плазма мембрану, већ и регулише организацију груписања GPI-AP и његову биолошку активност. Површина ћелије. Код квасца, ова студија је показала да C26 керамид-зависни GPI-AP кластер на ER може регулисати организацију кластера и функционалну активност GPI-AP на плазма мембрани (24, 49). У складу са овим моделом, GhLag1 ћелије су алергичне на GPI инхибиторе или лекове који утичу на интегритет ћелијског зида (28), а потреба за функционалним Gas1-GFP кластерима (49) врха керамида пројектованог у парењу ћелија квасца указује на G​​​ Могуће физиолошке последице hLag1 ћелија. Грешка GPI-AP. Међутим, даље тестирање да ли је функционална организација ћелијске површине програмирана из ЕР методом сортирања заснованом на дужини липида биће предмет нашег будућег истраживања.
Сојеви Saccharomyces cerevisiae коришћени у овом раду наведени су у Табели S1. Сојеви MMY1583 и MMY1635 SCLIM-а за снимање живих ћелија конструисани су у позадини W303. Ови сојеви који експресују Sec13-mCherry са флуоресцентном протеинском ознаком конструисани су коришћењем методе засноване на полимеразној ланчаној реакцији (PCR) са pFA6a плазмидом као шаблоном (23). Сој који експресује Mid2-iRFP обележен флуоресцентним протеином под контролом GAL1 промотера конструисан је на следећи начин. PCR амплификација iRFP-KanMx секвенце из pKTiRFP-KAN вектора (поклон Е. О'Шија, Addgene плазмид број 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; идентификатор истраживачког ресурса (RRID): Addgene_64687) и уметнута у C-терминус ендогеног Mid2. Након што је секвенца генома Mid2-iRFP амплификована и клонирана у GAL1 промотор, интегрисана је у Not I-Sac I место интеграционог плазмида pRS306. Добијени плазмид pRGS7 је линеаризован са Pst I да би се интегрисао у URA3 локус.
Фузиони ген Gas1-GFP се експресује под контролом GAL1 промотера у центромерном (CEN) плазмиду, који је конструисан на следећи начин. Gas1-GFP секвенца је амплификована PCR-ом из плазмида pRS416-GAS1-GFP (24) (поклон од L. Popolo) и клонирана у Xma I–Xho I место CEN плазмида pBEVY-GL LEU2 (поклон од C). Miller; Addgene плазмид број 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Добијени плазмид је назван pRGS6. Фузиони ген Axl2-GFP се такође експресује под контролом GAL1 промотера вектора pBEVY-GL LEU2, а његова конструкција је следећа. Секвенца Axl2-GFP је амплификована из плазмида pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) помоћу PCR-а и клонирана у Bam HI-Pst I место вектора pBEVY-GL LEU2. Добијени плазмид је назван pRGS12. Секвенца олигонуклеотида коришћених у овој студији је наведена у Табели S2.
Сој је допуњен са 0,2% аденина и 2% глукозе [YP-декстроза (YPD)], 2% рафинозом [YP-рафиноза] богатим протеином p (YP) екстракта квасца (1% екстракт квасца и 2% протеина ept). (YPR)] или 2% галактозом [YP-галактоза (YPG)] као извором угљеника, или у синтетичком минималном медијуму (0,15% азотне базе квасца и 0,5% амонијум сулфата) ради допуњавања одговарајућих аминокиселина и база потребних за исхрану, и који садржи 2% глукозе (синтетички минимални медијум глукозе) или 2% галактозе (синтетички минимални медијум галактозе) као извор угљеника.
За снимање у реалном времену, температурно осетљиве мутантне ћелије sec31-1 које експримирају конструкт под GAL1 промотором гајене су у YPR медијуму на 24°C преко ноћи до средине log фазе. Након индукције у YPG на 24°C током 1 сата, ћелије су инкубиране у SG на 37°C током 30 минута, а затим пребачене на 24°C ради ослобађања из блока секреције. Конканавалин А је коришћен за фиксирање ћелија на стакленој плочици и снимање помоћу SCLIM-а. SCLIM је комбинација инвертованог флуоресцентног микроскопа Olympus IX-71 и уљног сочива UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), ротирајућег конфокалног скенера велике брзине и високог односа сигнал-шум (Yokogawa Electric), прилагођеног спектрометра и прилагођеног хлађења. Појачивач слике система (Hamamatsu Photonics) може да обезбеди систем увећавајућих сочива са коначним увећањем од ×266,7 и камеру са уређајем са спрегнутим наелектрисањем која множи електроне (Hamamatsu Photonics) (21). Снимање слика се врши помоћу прилагођеног софтвера (Yokogawa Electric). За 3Д слике, користили смо прилагођени пиезоелектрични актуатор за вертикалну вибрацију објектива и сакупили оптичке делове на растојању од 100 nm у стек. Z-стек слика се конвертује у 3Д воксел податке, а теоријска функција распореда тачака која се користи за ротирајући конфокални микроскоп се користи за обраду деконволуције помоћу софтвера Volocity (PerkinElmer). Коришћењем софтвера Volocity за аутоматско одређивање прага за анализу колокације, измерен је ERES, укључујући терет. Анализа линијског скенирања је извршена помоћу софтвера MetaMorph (Molecular Devices).
Користите софтвер GraphPad Prism да бисте утврдили статистичку значајност. За двострани Студентов t-тест и обични једнофакторски тест анализе варијансе (ANOVA), сматра се да разлике између група имају значајан утицај на P <0,05 (*).
За флуоресцентну микроскопију Gas1-GFP, ћелије лог фазе су узгајане преко ноћи у YPD и сакупљене центрифугирањем, испране два пута фосфатно пуферованим физиолошким раствором и инкубиране на леду најмање 15 минута, а затим су обрађене под микроскопом као што је претходно описано (24). За аквизицију је коришћен Leica DMi8 микроскоп (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) опремљен објективом, L5 (GFP) филтером, Hamamatsu камером и софтвером Application Suite X (LAS X).
Узорци су денатурисани SDS пуфером за узорке на 65°C током 10 минута, а затим раздвојени SDS-полиакриламидном гел електрофорезом (PAGE). За имуноблотинг анализу, 10 μl узорка је напуњено по траци. Примарно антитело: Користити зечји поликлонални анти-Gas1 у разблажењу 1:3000, зечји поликлонални анти-Emp24 у разблажењу 1:500 и зечји поликлонални анти-GFP (поклон од Х. Ризмана) у разблажењу 1:3000. Мишје моноклонално анти-Pgk1 антитело је коришћено у разблажењу 1:5000 (поклон од Ј. де ла Круза). Секундарно антитело: Козји анти-зечји имуноглобулин G (IgG) конјугован са реновом пероксидазом (HRP) коришћен у разблажењу 1:3000 (Pierce). HRP-коњуговани козји анти-мишји IgG коришћен је у разблажењу 1:3000 (Pierce). Зона имуног одговора је посматрана методом хемилуминесценције реагенса SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Као што је описано у (31), експеримент природне имунопреципитације је спроведен на обогаћеној ЕР фракцији. Укратко, ћелије квасца су испране ТНЕ пуфером [50 mM трис-ХЦл (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM фенилметилсулфонил флуорида и смеша инхибитора протеазе) на 600 nm (OD600) при оптичкој густини од 100 два пута. Разбијен је стакленим перлама, а затим су ћелијски остаци и стаклене перле уклоњени центрифугирањем. Супернатант је затим центрифугиран на 17.000 g током 15 минута на 4°C. Талог је ресуспендован у ТНЕ и додат је дигиталис сапонин до коначне концентрације од 1%. Суспензија је инкубирана 1 сат уз ротацију на 4°C, а затим су нерастворљиве компоненте уклоњене центрифугирањем на 13.000 g на 4°C током 60 минута. За Gas1-GFP имунопреципитацију, прво инкубирајте узорак са празним агарозним перлама (ChromoTek) на 4°C током 1 сата, а затим инкубирајте са GFP-Trap_A (ChromoTek) на 4°C током 3 сата. Имунопреципитиране перле су испране пет пута са TNE који садржи 0,2% дигоксигенина, елуиране са SDS пуфером за узорке, раздвојене на SDS-PAGE и анализиране имуноблотингом.
Као што је описано у (31), одређивање умрежавања је извршено на обогаћеној ЕР фракцији. Укратко, обогаћена ЕР фракција је инкубирана са 0,5 mM дитиобис(сукцинимидил пропионатом) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, САД; 20°C, 20 мин). Реакција умрежавања је прекинута додавањем глицина (коначна концентрација 50 mM, 5 минута, 20°C).
Као што је претходно описано (50), спроведена је MS анализа церамида у дивљем типу и GhLag1 сојевима. Укратко, ћелије су узгајане до експоненцијалне фазе (3 до 4 OD600 јединице/мл) у YPD на 30°C, и сакупљено је 25×107 ћелија. Њихов метаболизам је заустављен трихлорсирћетном киселином. Користити растварач за екстракцију [етанол, вода, етар, пиридин и 4,2 N амонијум хидроксид (15:15:5:1:0,018 v/v)] и 1,2 nmol интерног стандарда C17 церамида (860517, Avanti поларни липид) квалитета). Користити монометиламински реагенс [метанол, вода, n-бутанол и раствор метиламина (4:3:1:5 v/v)] да би се извршила блага алкална хидролиза екстракта, а затим користити n-бутанол засићен водом за десољење. Коначно, екстракт је ресуспендован у растварачу позитивног мода [хлороформ/метанол/вода (2:7:1) + 5 mM амонијум ацетат] и убризган у масени спектрометар. Вишеструко реакционо праћење (MRM) је извршено за идентификацију и квантификацију молекула сфинголипида. Терцијарни квадруполни масени спектрометар TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) је опремљен роботским нанопроточним јонским извором Nanomate HD (Advion Biosciences, Итака, Њујорк) за анализу липида. Енергија судара је оптимизована за сваку категорију церамида. MS подаци су добијени у позитивном моду. За сваку биолошку реплику, липидни сигнал је медијана три независна мерења.
Као што је описано у (31), ћелије (800×107) које експресују Gas1-GFP подвргнуте су природној имунопреципитацији. Пречишћени Gas1-GFP је одвојен помоћу SDS-PAGE и пребачен на поливинилиден флуоридну (PVDF) мембрану. Протеин је визуализован бојењем PVDF амидном црном бојом. Gas1-GFP трака је исечена са PVDF и испрана 5 пута метанолом и једном водом квалитета за течну хроматографију-MS (LC-MS). Инкубацијом мембранске траке са 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), пуфером и 500μl свеже растворене 1 M смеше натријум нитрита на 37°C током 3 сата, липидна фракција се ослобађа из Gas1-GFP и лизира се ослобађање инозин фосфат церамида између глукозамина и инозитола (51). Након тога, мембранска трака је испрана четири пута водом квалитета за LC-MS, осушена на собној температури и чувана у атмосфери азота на -80°C до анализе. Као контрола, за сваки експеримент је коришћен празан узорак PVDF мембране. Липид екстрахован из Gas1-GFP је затим анализиран MS методом као што је описано (50). Укратко, PVDF траке које садрже GPI-липид су ресуспендоване у 75 μl негативног растварача за калуп [хлороформ/метанол (1:2) + 5 mM амонијум ацетат] и прошле су кроз анализу сфинголипидних врста електроспреј јонизацијом (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). У овом случају, MS подаци су добијени у режиму негативних јона.
Као што је раније поменуто, липидни део GPI сидра је одвојен од GPI-AP обележеног [3H]-инозитолом (16). Липиди су одвојени танкослојном хроматографијом коришћењем система растварача (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) и визуелизовани коришћењем FLA-7000 (Fujifilm).
Ћелије које експресују Gas1-GFP (600×107) су два пута испране TNE пуфером и разбијене стакленим перлама, а затим центрифугиране да би се уклонили ћелијски остаци и стаклене перле. Супернатант је затим центрифугиран на 17.000 g током 1 сата на 4°C. Талог је испран у TNE и инкубиран са 1 U PI-PLC (Invitrogen) у TNE који садржи 0,2% дигиталис сапонина током 1 сата на 37°C. Након третмана ензимом, мембрана је уклоњена центрифугирањем на 17.000 g на 4°C током 1 сата. Да би се имунопреципитирао Gas1-GFP, супернатант је инкубиран са GFP-Trap_A (ChromoTek) на 4°C преко ноћи. Пречишћени Gas1-GFP одвојен SDS-PAGE је обојен Coomassie бриљант плавом бојом. Трака за бојење Gas1-GFP је одсечена од сиве боје која окружује аквадукт, а затим, након алкилације јодоацетамидом и редукције дитиотреитолом, извршена је ин-гел дигестија са трипсином. Екстраховани и осушени триптични пептиди и пептиди са GPI-гликанима. Осушени пептид је растворен у 20 μl воде. Убризгати део (8 μl) у LC. За раздвајање пептида под специфичним градијентним условима коришћена је октадецилсиланска (ODS) колона (Develosil 300ODS-HG-5; унутрашњи пречник 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, префектура Аичи, Јапан). Мобилна фаза је растварач А (0,08% мравља киселина) и растварач Б (0,15% мравља киселина у 80% ацетонитрилу). За елуирање колоне растварачем А у року од 55 минута при брзини протока од 50 μl min-1 током 5 минута коришћен је Accela HPLC систем (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Масачусетс), а затим је концентрација растварача Б повећана на 40%. (Thermo Fisher Scientific, Сједињене Америчке Државе). Елуат је континуирано увођен у ESI јонски извор, а триптински пептиди и пептиди са GPI-гликанима анализирани су помоћу LTQ Orbitrap XL (хибридни линеарни јонски замка-орбитрап масени спектрометар; Thermo Fisher Scientific). У MS подешавању, напон капиларног извора је подешен на 4,5 kV, а температура преносне капиларе је одржавана на 300°C. Напон капиларе и напон цеви су подешени на 15 V и 50 V, респективно. MS подаци су добијени у режиму позитивних јона (резолуција од 60.000; тачност масе од 10 делова на милион) у опсегу масе од 300/m/z односа маса/наелектрисање (m/z) 3000. MS/MS подаци су добијени преко јонске замке у LTQ Orbitrap XL [прве 3 цифре од којих подаци зависе, дисоцијација изазвана сударом (CID)].
МД симулације су извршене коришћењем софтвера GROMACS (52) и MARTINI 2 силовог поља (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) је затим коришћен за конструисање двослоја који садржи диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) и Cer C18 или DOPC и Cer C26. Топологија и координате Cer C26 су изведене из DXCE уклањањем додатних перли из сфингозинског репа. Користите процес описан у наставку да бисте уравнотежили двослој и покренули га, а затим користите последње координате система да бисте изградили систем који садржи Emp24. Трансмембрански домен квасца Emp24 (остаци 173 до 193) је конструисан као α-хеликс коришћењем алата за визуелну МД (VMD) молекуларну структуру (58). Затим, након уклањања преклапајућих липида, протеин је грубо гранулиран и уметнут у двослој коришћењем CHARMM GUI-ја. Коначни систем садржи 1202 DOPC и 302 Cer C26 или 1197 DOPC и 295 Cer C18 и Emp24. Систем се јонизује до концентрације од 0,150 M. Направљене су четири независне репликације за две двослојне композиције.
Липидни двослој је балансиран коришћењем CHARMM GUI процеса, који укључује минимизирање, а затим балансирање 405.000 корака, где се ограничења положаја постепено смањују и елиминишу, а временски корак се повећава са 0,005 ps на 0,02 ps. Након еквилибрације, производи 6 µs са временским кораком од 0,02 ps. Након уметања Emp24, користите исти CHARMM GUI процес да бисте минимизирали и балансирали систем, а затим га покренули 8 s у продукцији.
За све системе, током процеса балансирања, притисак се контролише помоћу Берендсеновог баростата (59), а током процеса производње, притисак се контролише помоћу Паринело-Рахмановог баростата (60). У свим случајевима, просечан притисак је 1 бар и користи се полуизотропна шема спрезања притиска. У процесу балансирања и производње, термостат (61) са рекалибрацијом брзине се користи за спрезање температуре честица протеина, липида и растварача, респективно. Током целог рада, циљна температура је 310 К. Интеракција без везивања се израчунава генерисањем листе упаривања коришћењем Верлетове шеме са толеранцијом пуфера од 0,005. Кулонов члан се израчунава коришћењем реакционог поља и граничне удаљености од 1,1 nm. Вандер-Ваалсов члан користи граничну шему са граничном удаљеношћу од 1,1 nm, а Верлетова гранична шема се користи за потенцијални дрифт (62).
Користећи VMD, гранична таласна дужина између DOPC фосфатних перли или ceramid AM1 перли и протеина је 0,7 nm, а израчунава се број липида који интерагују са протеином. Према следећој формули, израчунајте фактор осиромашења-обогаћивања (DE) као у (63): DE фактор = (количина укупних липида у протеину 0,7) у протеину 0,7 (количина Cer у укупним липидима)
Пријављена вредност се добија као просек, а траке грешака су четири независне копије једностране дистрибуције. Статистичка значајност DE фактора се израчунава t-тестом [(просекDE-фактор-1)/SE]. Израчунајте P вредност из једностране дистрибуције.
Алат GROMACS је коришћен за израчунавање 2D латералне мапе густине система који садржи Emp24 у последњих 250 ns трага. Да би се добила мапа обогаћивања/осиромашења церамида, мапа густине Cer је подељена збиром мапе Cer и DOPC, а затим подељена концентрацијом Cer у телу. Коришћена је иста скала мапе боја.
За додатне материјале за овај чланак, погледајте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ово је чланак отвореног приступа дистрибуиран под условима Creative Commons Attribution-Non-Commercial лиценце, која дозвољава употребу, дистрибуцију и репродукцију у било ком медијуму, све док коначна употреба није у комерцијалне сврхе и док је претпоставка да је оригинално дело исправно. Референца.
Напомена: Молимо вас да наведете своју адресу е-поште само да би особа коју препоручујете страници знала да желите да види имејл и да то није спам. Нећемо бележити никакве адресе е-поште.
Ово питање се користи да се провери да ли сте посетилац и спречи аутоматско слање спама.
Софија Родригез-Галардо, Казуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортез · Гомез (Алехандро Кортес-Гомез), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерија Зони (Валерија Зони), Ауксилијадора Агилера-Ромеро, С. Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мијако Риман (Мијако Риман), Проу Акира, Стефано Фани, Акихико Накано, Мануел Муниз
3Д снимање високе резолуције у реалном времену открива важност дужине ланца керамида за сортирање протеина на селективним излазним местима.
Софија Родригез-Галардо, Казуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортез · Гомез (Алехандро Кортес-Гомез), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерија Зони (Валерија Зони), Ауксилијадора Агилера-Ромеро, С. Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мијако Риман (Мијако Риман), Проу Акира, Стефано Фани, Акихико Накано, Мануел Муниз
3Д снимање високе резолуције у реалном времену открива важност дужине ланца керамида за сортирање протеина на селективним излазним местима.
©2020 Америчко удружење за унапређење науке. сва права задржана. АААС је партнер ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ЦХОРУС, ЦЛОЦКСС, ЦроссРеф и ЦОУНТЕР. СциенцеАдванцес ИССН 2375-2548.