Јаваскрипт је тренутно онемогућен у вашем прегледачу. Неке функције ове веб странице неће радити када је јаваскрипт онемогућен.
Региструјте се са својим специфичним подацима и специфичним леком који вас занима, а ми ћемо упарити информације које наведете са чланцима у нашој опсежној бази података и одмах вам послати ПДФ копију е-поштом.
Грануле Бан-Лан-Ген ублажавају хронични рецидивни колитис изазван декстран натријум сулфатом код мишева модулирањем цревне микробиоте и обнављањем производње цревних SCFA изведених из GLP-1
Ђао Пенг,1-3,*Ли Си,4,*Женг Лин,3,5 Дуан Лифанг,1 Гао Женгсијан,2,5 Дијеху,1 Ли Ђие,6 Ли Сјаофенг,6 Шен Сјангчун,5 Сјао Хаитао21 Пекиншка универзитетска болница у Шенжену, Одељење за фармацију, Шенжен, Народна Република Кина; 2 Здравствено-научни центар Универзитета у Шенжену, Фармацеутски факултет, Шенжен, Народна Република Кина; 3 Медицински универзитет у Гујџоу, Истраживачки центар за инжењерску технологију етничке медицине и развој и примену традиционалне кинеске медицине, Министарство просвете, Кључна лабораторија за фармацију покрајине Гујџоу, Медицински универзитет у Гујџоу, Гујјанг, Народна Република Кина; 4 Одељење за гастроентерологију, Пекиншка универзитетска болница у Шенжену, Шенжен, Народна Република Кина; 5 Фармацеутски факултет, Медицински универзитет у Гујџоу, Државна кључна лабораторија за функцију и примену лековитих биљака, Гујјанг; 6 Одељење за лабораторијску медицину, Универзитетска болница у Пекингу, Шенжен, Кина [email protected] Шен Сјангчун, Фармацеутски факултет, Медицински универзитет Гуејџоу, Гуејџоу, Народна Република Кина, 550004, имејл [email protected] Циљ: Терапија заснована на ГЛП-1 је нова опција лечења инфламаторне болести црева. Грануле Бан-Лан-Ген (БЛГ) су позната антивирусна ТЦМ формулација која показује потенцијално антиинфламаторно дејство у лечењу различитих инфламаторних стања. Међутим, његов антиинфламаторни ефекат на колитис и његов механизам деловања још увек нису јасни. МЕТОДЕ: Утврђивање хроничног рецидивирајућег колитиса изазваног декстран натријум сулфатом (ДСС) код мишева. Индекси активности болести, хистолошки маркери повреде и нивои проинфламаторних цитокина су извршени да би се проценио заштитни ефекат БЛГ. Ефекти БЛГ на цревну микробиоту и црева окарактерисани су нивоима ГЛП-1 у серуму и експресијом Гцг дебелог црева, ГПР41 и ГРП43, саставом цревне микробиоте, нивоима СЦМА у фецесу и ослобађањем ГЛП-1 из Примарне ћелије дебелог црева миша, производња GLP-1 изведена из SCFA. Резултати: BLG третман је значајно смањио губитак телесне тежине, DAI, скраћивање дебелог црева, оштећење ткива дебелог црева и нивое проинфламаторних цитокина TNF-α, IL-1β и IL-6 у ткиву дебелог црева. Поред тога, BLG третман може значајно обновити експресију Gcg, GPR41 и GRP43 у дебелом цреву и нивое GLP-1 у серуму код мишева са колитисом, и повећањем бактерија које производе SCFA као што су Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001, и смањењем бројности бактерија као што су Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas и Oscillibacter. Поред тога, BLG третман може значајно повећати ниво SCFA у фецесу мишева са колитисом. Истовремено, in vitro експерименти су такође показали да фекални екстракт мишева третираних BLG може значајно стимулисати примарне мале ћелије мишјег дебелог црева које луче GLP-1. Закључци: Ови налази указују на то да BLG има антиколитисни ефекат. BLG има потенцијал да се развије као терапија, барем делимично модулирањем цревне микробиоте и обнављањем производње GLP-1 изведених из цревних SCFA. Обећавајући лекови за хронични рецидивирајући колитис. Кључне речи: колитис, Ban-Lan-Gen грануле, цревна микробиота, кратколанчане масне киселине, GLP-1
Улцерозни колитис (УК) је дуготрајна инфламаторна болест дебелог црева и ректума коју карактеришу рекурентна дијареја, бол у стомаку, губитак тежине и мукопурулентна крвава столица.1 У последње време, преваленција УК расте у земљама са раније ниском инциденцом, укључујући Кину, са све већом популарношћу западног начина живота.2 Ово повећање представља велике проблеме за јавно здравље и има озбиљне импликације на способност пацијената за рад и квалитет живота. Приметно је да патогенеза УК остаје углавном нејасна, али је општеприхваћено да генетика, фактори околине, цревна микробиота и имуни систем доприносе развоју УК.3 Чак и сада, не постоји лек за УК, а циљ лечења је клинички контролисати клиничке симптоме, изазвати и одржавати ремисију, подстаћи зарастање слузокоже и смањити рецидив. Класични третмани укључују аминосалицилате, кортикостероиде, имуносупресоре и биолошке лекове. Међутим, ови лекови не могу постићи жељени ефекат због својих различитих нежељених ефеката.4 Недавно су многе студије случајева показале да је традиционална кинеска медицина (ТКМ) показала велики потенцијал у ублажавању УК. са ниском токсичношћу, што указује на то да је развој нових ТЦМ терапија обећавајућа стратегија лечења за улцерозни колитис.5-7
Банланген грануле (БЛГ) су препарат традиционалне кинеске медицине направљен од воденог екстракта корена Банлангена.8 Поред своје антивирусне ефикасности, БЛГ показује потенцијално антиинфламаторно дејство у лечењу различитих инфламаторних стања.9,10 Поред тога, глукозинолати (Р,С-гоитрин, прогоитрин, епипрорубин и глукозид су изоловани и идентификовани из водених екстраката Радикс исатидис) и нуклеозиди (хипоксантин, аденозин, уридин и гванозин) и индиго алкалоиди као што су индиго и индирубин.11,12 Претходне студије су добро документовале да једињења аденозин, уридин и индирубин показују снажне антиколитичне ефекте код различитих животињских модела колитиса.13-17 Међутим, нису спроведене студије засноване на доказима за процену ефикасности БЛГ код колитиса. У овој студији, истражили смо заштитни ефекат БЛГ на хронични рецидивирајући колитис изазван декстран натријум сулфатом (ДСС) код мишева C57BL/6 и открили да орална примена БЛГ значајно ослабљује хроничну рецидивирајућу упалу дебелог црева изазвану ДСС-ом код мишева, њени регулаторни механизми су повезани са модулацијом цревне микробиоте и обнављањем производње глукагон-сличног пептида-1 (ГЛП-1) изведеног из црева.
БЛГ грануле (без шећера, одобрене од стране НМПА Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Пекинг, Кина; број серије: 20110966) су купљене у апотекама. DSS (молекулска тежина: 36.000–50.000 далтона) је купљен од МП Биологицалс (Санта Ана, САД). Сулфасалазин (SASP) (чистоћа ≥ 98%), хематоксилин и еозин су купљени од Сигма-Олдрич (Сент Луис, Мисури, САД). Комплети за елиса тестове за мишји TNF-α, IL-1β и IL-6 луминекс су купљени од Р&Д системс (Минеаполис, Минесота, САД). Сирћетна киселина, пропионска киселина и бутерна киселина су купљене од Аладин Индустриес (Шангај, Кина). 2-Етилбутерна киселина је купљена од Мерк КГаА (Дармштат, Немачка).
Мужјаци мишева C57BL/6 старости 6-8 недеља (телесне тежине 18-22 г) купљени су од Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Пекинг, Кина) и смештени су у окружењу од 22 ± 2 °C са циклусом светлости/мрака од 12 сати. Мишеви су храњени стандардном исхраном за глодаре са слободним приступом води за пиће током једне недеље како би се аклиматизовали на ново окружење. Мишеви су затим насумично подељени у четири групе: контролна група, DSS модел група, група третирана SASP-ом (200 мг/кг, орално) и група третирана BLG-ом (1 г/кг, орално). Као што је приказано на слици 1А, према нашој претходној студији, експериментални хронични рецидивни колитис је индукован код мишева са три циклуса 1,8% DSS-а током 5 дана, након чега је уследила дестилована вода током 7 дана, према нашој претходној студији.18 Мишеви у групама третираним SASP-ом и BLG-ом третирани су SASP-ом и BLG-ом, респективно, сваког дана почев од дана 0. Према прелиминарним експериментима, доза BLG-а је била постављено на 1 г/кг. У међувремену, доза SASP-а је постављена на 200 мг/кг према литератури.4 Контролна и DSS модел група су примале исту запремину воде током целог експеримента.
Слика 1 БЛГ ублажава хронични рецидивни колитис изазван ДСС-ом код мишева. (А) Експериментални дизајн хроничног рекурентног колитиса и лечење, (Б) промена телесне тежине, (Ц) резултат индекса активности болести (ДАИ), (Д) дужина дебелог црева, (Е) репрезентативна слика дебелог црева, (Ф) Х&Е бојење дебелог црева (увећање, ×100) и (Г) хистолошки резултат. Подаци су представљени као средња вредност ± СЕМ (н = 6).##p < 0,01 или ###p < 0,001 у односу на контролну (Кон) групу; *p < 0,05 или **p < 0,01 или ***p < 0,001 у односу на ДСС групу.
Телесна тежина, конзистенција столице и ректално крварење су бележени свакодневно. Индекс активности болести (DAI) је одређен комбиновањем резултата телесне тежине, конзистенције столице и ректалног крварења као што је претходно описано.19 На крају експеримента, сви мишеви су еутаназирани, а крв, фецес и дебело црево су сакупљени за даље експерименте.
Ткиво дебелог црева је фиксирано формалином и уграђено у парафин. Направљени су пресеци од 5 микрона и обојени хематоксилин-еозином (H&E), затим ослепљени и бодовани као што је претходно описано.19
Укупна РНК ткива дебелог црева је екстрахована помоћу Тризол реагенса (Invitrogen, Карлсбад, Калифорнија), након чега је уследила екстракција цДНК реверзном транскриптазом (TaKaRa, Кусацу, Шига, Јапан). Квантитативна ПЦР је извршена коришћењем система за ПЦР у реалном времену са SYBR Green Master (Roche, Базел, Швајцарска). Транскрипти циљних гена су нормализовани на β-актин, а подаци су анализирани коришћењем 2-ΔΔCT методе. Секвенце прајмера гена су приказане у Табели 1.
Примарна изолација и култура ћелија дебелог црева мишева извршена је као што је претходно описано.20 Укратко, дебело црево мишева старих 6-8 недеља прво је исечено након жртвовања цервикалном дислокацијом, затим уздужно отворено, третирано Ханксовим уравнотеженим раствором соли (HBSS, без калцијума и магнезијума) и исечено на мале комаде величине 0,5-1 мм. Након тога, ткива су дигестирана са 0,4 мг/мл колагеназе XI (Sigma, Poole, UK) у слободном DMEM медијуму и центрифугирана на 300 xg током 5 минута на собној температури. Ресуспендовати талог у DMEM медијуму (допуњеном са 10% феталног говеђег серума, 100 јединица/мл пеницилина и 100 µг/мл стрептомицина) на 37 °C и пропустити кроз најлонску мрежу (величина пора ~250 µм). Аликвоти ћелија дебелог црева су стављени у посуде са стакленим дном и инкубирани са сирћетном киселином, пропионском киселином, бутерном киселином и екстрактима мишјег фецеса током 2 сата на 37°C, 5% CO2.
Ткиво дебелог црева је хомогенизовано са PBS, а нивои цитокина IL-6, TNF-α и IL-1β у ткиву дебелог црева су детектовани коришћењем luminex ELISA комплета за анализу (R&D systems, Минеаполис, Минесота, САД). Слично томе, нивои GLP-1 у серуму и медијуму за култивацију примарних ћелија мишјег епитела дебелог црева су одређени помоћу ELISA комплета (Bioswamp, Вухан, Кина) према упутствима произвођача.
Укупна ДНК из фецеса је екстрахована коришћењем комплета за екстракцију ДНК (Tiangen, Кина). Квалитет и количина ДНК су мерени у односима 260 nm/280 nm и 260 nm/230 nm, респективно. Након тога, користећи сваку екстраховану ДНК као шаблон, специфични прајмери ​​338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) и 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) су коришћени за амплификацију V3-V4 региона 16S рРНК гена у различитим регионима. PCR производи су пречишћени коришћењем QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Немачка), квантификовани помоћу PCR-а у реалном времену и секвенционирани коришћењем IlluminaMiseq PE300 платформе за секвенцирање (Illumina Inc., CA, САД). За биоинформатичку анализу, обрада података је извршена према претходно објављеним протоколима.21,22 Укратко, користите Cutadapt (V1.9.1) за филтрирање сирових експресних датотека. OTU су груписани коришћењем UPARSE (верзија 7.0.1001) са граничном вредношћу сличности од 97%, а UCHIME је коришћен за уклањање химерних секвенци. Анализа састава заједнице и класификација су извршене коришћењем RDP класификатора (http://rdp.cme.msu.edu/) на основу SILVA базе података гена рибозомалне РНК.
Нивои масних киселина кратког ланца (сирћетне киселине, пропионске киселине и бутерне киселине) мерени су као што је претходно описано од стране Тао и др., са неким модификацијама.23 Укратко, 100 мг фецеса је прво суспендовано у 0,4 мл дејонизоване воде, затим у 0,1 мл 50% сумпорне киселине и 0,5 мл 2-етилбутерне киселине (интерни стандард), затим хомогенизовано и загрејано на 4°C. Центрифугирати на 12.000 о/мин током 15 минута на 50°C. Супернатант је екстрахован са 0,5 mL етра и убризган у GC ради анализе. За анализу гасном хроматографијом (GC), узорци су анализирани помоћу GC-2010 Plus гасног хроматографа (Shimadzu, Inc.) опремљеног детектором пламене јонизације (FID). Раздвајање је постигнуто коришћењем ZKAT-624 колоне, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Кина). Подаци су прикупљени коришћењем GC софтвера за растворе (Shimadzu, Inc.). Однос поделе је био 10:1, гас носач је био азот, а брзина протока 6 mL/min. Запремина убризгавања је била 1 μL. Температура убризгавача и детектора је била 300°C. Температура пећи је одржавана на 140°C током 13,5 минута, а затим повећана на 250°C брзином од 120°C/min; Температура је одржавана 5 минута.
Подаци су представљени као средња вредност ± стандардна грешка средње вредности (SEM). Значајност података је процењена једнофакторском ANOVA анализом, након чега је примењен Данканов тест вишеструких опсега. За сва израчунавања коришћен је софтвер GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., Сан Дијего, Калифорнија, САД), а p < 0,05 је сматрано статистички значајним.
Добро је познато да је улцерозни колитис хронична рецидивирајућа колитисна болест са јаким боловима у стомаку, дијарејом и крварењем. Стога је утврђен хронични рецидивирајући колитис изазван ДСС-ом код мишева како би се проценила ефикасност БЛГ-а против колитиса (Слика 1А). У поређењу са контролном групом, мишеви у ДСС модел групи имали су значајно смањену телесну тежину и већи ДАИ, а ове промене су значајно преокренуте након 24 дана третмана БЛГ-ом (Слика 1Б и Ц). Скраћивање дебелог црева је важан обележје УЛЦ-а. Као што је приказано на сликама 1Д и Е, дужина дебелог црева мишева који су примали ДСС била је значајно скраћена, али је третман БЛГ-ом ублажен. Накнадно је извршена хистопатолошка анализа како би се проценила упала дебелог црева. Слике обојене Х&Е и патолошки резултати показали су да је примена ДСС-а значајно пореметила архитектуру дебелог црева и довела до уништења крипте, док је третман БЛГ-ом значајно смањио уништење крипте и патолошке резултате (Слика 1Ф и Г). Приметно је да је заштитни ефекат БЛГ-а у дози од 1 г/кг био упоредив са оним код SASP-а у дози од од 200 мг/кг. Заједно, ови налази указују на то да је БЛГ ефикасан у смањењу тежине хроничног рецидивирајућег колитиса изазваног ДСС-ом код мишева.
TNF-α, IL-1β и IL-6 су важни инфламаторни маркери упале дебелог црева. Као што је приказано на слици 2А, DSS је изазвао значајно повећање експресије гена TNF-α, IL-1β и IL-6 у дебелом цреву у поређењу са контролном групом. Примена BLG-а може значајно да преокрене ове промене посредоване DSS-ом. Затим смо користили ELISA тест да бисмо одредили нивое инфламаторних цитокина TNF-α, IL-1β и IL-6 у ткиву дебелог црева. Резултати су такође показали да су нивои TNF-α, IL-1β и IL-6 у дебелом цреву значајно повећани код мишева третираних DSS-ом, док је третман BLG-ом ублажио ова повећања (слика 2Б).
Слика 2 БЛГ инхибира експресију гена и производњу проинфламаторних цитокина TNF-α, IL-1β и IL-6 у дебелом цреву мишева третираних DSS-ом. (А) Експресија гена TNF-α, IL-1β и IL-6 у дебелом цреву; (Б) нивои протеина дебелог црева TNF-α, IL-1β и IL-6. Подаци су приказани као средња вредност ± SEM (n = 4–6).#p < 0,05 или ##p < 0,01 или ###p < 0,001 у односу на контролну (Con) групу; *p < 0,05 или **p < 0,01 у односу на DSS групу.
Интестинална дисбиоза је критична у патогенези улцерозног колитиса (УЦ).24 Да би се истражило да ли БЛГ модулира цревну микробиоту мишева третираних ДСС-ом, извршено је секвенцирање 16С рРНК ради анализе бактеријске заједнице садржаја црева. Венов дијаграм показује да три групе деле 385 ОТУ. Истовремено, свака група је имала јединствене ОТУ (Слика 3А). Штавише, индекс Чао1 и Шенонов индекс приказани на слици 3Б и Ц показали су да је разноликост заједнице цревне микробиоте смањена код мишева третираних БЛГ-ом, јер је Шенонов индекс значајно смањен у групи третираној БЛГ-ом. Анализа главних компоненти (ПЦА) и анализа главних координата (ПЦоА) коришћене су за одређивање образаца груписања међу три групе и показале су да је структура заједнице мишева третираних ДСС-ом јасно раздвојена након третмана БЛГ-ом (Слика 3Д и Е). Ови подаци сугеришу да је третман БЛГ-ом значајно утицао на структуру заједнице мишева са колитисом изазваним ДСС-ом.
Слика 3 БЛГ мења разноликост цревне микробиоте код мишева са колитисом изазваним DSS-ом. (А) Венов дијаграм OTU, (Б) Chao1 индекс, (Ц) Шенонов индекс богатства, (Д) График резултата анализе главних компоненти (PCA) OTU, (Е) Слика резултата анализе главних координата (PCoA) OTU. Подаци су представљени као средња вредност ± SEM (n = 6).**p < 0,01 у односу на DSS групу.
Да бисмо проценили специфичне промене у фекалној микробиоти, анализирали смо састав цревне микробиоте на свим таксономским нивоима. Као што је приказано на слици 4А, главни филуми у свим групама били су Firmicutes и Bacteroidetes, а затим Verrucomicrobia. Релативна количина Firmicutes и однос Firmicutes/Bacteroidetes били су значајно повећани у фекалним микробним заједницама мишева третираних DSS-ом у поређењу са контролним мишевима, а ове промене су значајно обрнуте након третмана BLG-ом. Конкретно, третман BLG-ом је значајно повећао релативну количину Verrucobacterium у фецесу мишева са колитисом изазваним DSS-ом. На нивоу домаћинства, фекалне микробне заједнице су заузимале Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae и Prevotellaceae (слика 4Б). У поређењу са DSS групом, смањење BLG-а је повећало количину Akkermansiaceae, али је смањило количину Lachnospiraceae и Ruminococcaceae. Приметно је да је на нивоу рода, Фекалну микробиоту су заузимале Lachnospira_NK4A136_група, Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001 (Сл. 4C). Ово откриће је такође показало да је BLG третман ефикасно преокренуо неравнотежу микробиоте као одговор на DSS изазов, што је окарактерисано смањењем Eubacterium_xylanophilum_групе, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas и Oscillibacter, и повећањем Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001.
Слика 4 БЛГ мења обиље цревне микробиоте код мишева са колитисом изазваним DSS-ом. (А) Обиље цревне микробиоте на нивоу типа; (Б) Обиље цревне микробиоте на нивоу породице; (Ц) Обиље цревне микробиоте на нивоу рода. Подаци су приказани као средња вредност ± SEM (n = 6).#p < 0,05 или ###p < 0,001 у односу на контролну (Con) групу; *p < 0,05 или **p < 0,01 или ***p < 0,001 у односу на DSS групу.
Узимајући у обзир да су кратколанчане масне киселине (SCFA) главни метаболити Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001, док су ацетат, пропионат и бутират најзаступљеније SCFA у цревном лумену, 25-27 још увек смо у нашој студији. Као што је приказано на слици 5, концентрације фекалног ацетата, пропионата и бутирата су значајно смањене у групи третираној DSS-ом, док је третман BLG могао у великој мери сузбити ово смањење.
Слика 5. БЛГ повећава нивое кратколанцетних масних киселина (SCFA) у фецесу мишева са колитисом изазваним DSS-ом. (А) Садржај сирћетне киселине у фецесу; (Б) Садржај пропионске киселине у фецесу; (Ц) Садржај бутерне киселине у фецесу. Подаци су приказани као средња вредност ± SEM (n = 6). #p < 0,05 или ##p < 0,01 у односу на контролну (Con) групу; *p < 0,05 или **p < 0,01 у односу на DSS групу.
Даље смо израчунали Пирсонов коефицијент корелације између диференцијалних SCFA на нивоу рода и фекалне микробиоте. Као што је приказано на слици 6, Akkermansia је била позитивно корелирана са производњом пропионске киселине (Pearson = 0,4866) и бутерне киселине (Pearson = 0,6192). Насупрот томе, и Enteromonas и Oscillobacter су били негативно повезани са производњом ацетата, са Пирсоновим коефицијентима од 0,4709 и 0,5104, респективно. Слично томе, Ruminococcaceae_UCG-014 је била негативно корелирана са производњом пропионске киселине (Pearson = 0,4508) и бутерне киселине (Pearson = 0,5842), респективно.
Слика 6 Пирсонова корелациона анализа између диференцијалних SCFA и микроба дебелог црева. (А) Ентеромонада са сирћетном киселином; (Б) Бацил потреса мозга са сирћетном киселином; (Ц) Акермансија у односу на пропионску киселину; (Д) Руминококус_UCG-014 са пропионском киселином; (Е) Акермансија са бутерном киселином; (Ф) Руминококус_UCG-014 са бутерном киселином.
Глукагон-сличан пептид-1 (ГЛП-1) је посттранслациони производ проглукагона (Гцг) специфичан за ћелијски тип са антиинфламаторним својствима.28 Као што је приказано на слици 7, ДСС је индуковао значајно смањење експресије Гцг мРНК. Третман дебелог црева и БЛГ-ом могао је значајно да преокрене смањење Гцг изазвано ДСС-ом у поређењу са контролном групом (слика 7А). Истовремено, ниво ГЛП-1 у серуму је значајно смањен у групи третираној ДСС-ом, а третман БЛГ-ом могао је у великој мери да спречи ово смањење (слика 7Б). Пошто масне киселине кратког ланца могу да стимулишу секрецију ГЛП-1 путем активације рецептора 43 спрегнутог са Г-протеином (ГРП43) и рецептора 41 спрегнутог са Г-протеином (ГРП41), такође смо испитали ГПР41 и ГРП43 у дебелом цреву мишева са колитисом и открили да је експресија ГРП43 и ГПР41 мРНК у дебелом цреву значајно смањена након изазивања ДСС-ом, а третман БЛГ-ом могао је ефикасно да спасе ова смањења (слика 7Ц и Д).
Слика 7 БЛГ повећава нивое ГЛП-1 у серуму и експресију мРНК Гцг, ГПР41 и ГРП43 у дебелом цреву код мишева третираних ДСС-ом. (А) Експресија Гцг мРНК у ткиву дебелог црева; (Б) Ниво ГЛП-1 у серуму; (Ц) Експресија ГПР41 мРНК у ткиву дебелог црева; (Д) Експресија ГПР43 мРНК у ткиву дебелог црева. Подаци су приказани као средња вредност ± СЕМ (н = 5–6). #p < 0,05 или ##p < 0,01 у односу на контролну (Con) групу; *p < 0,05 у односу на ДСС групу.
Пошто је третман БЛГ-ом могао да повећа нивое ГЛП-1 у серуму, експресију мРНК Гцг у дебелом цреву и нивое СЦФА у фецесу код мишева третираних ДСС-ом, даље смо испитали ацетат, пропионат и бутират, као и код контролних (Ф-Кон), ДСС колитиса (Ф-Кон) -ДСС) и БЛГ-третираног колитиса (Ф-БЛГ) мишева на ослобађање ГЛП-1 из примарних ћелија мишјег епитела дебелог црева. Као што је приказано на слици 8А, примарне ћелије мишјег епитела дебелог црева третиране са 2 мМ сирћетне киселине, пропионске киселине и бутерне киселине, респективно, значајно су стимулисале ослобађање ГЛП-1, што је у складу са претходним студијама.29,30 Слично томе, сви Ф-Кон, Ф-ДСС и Ф-БЛГ (еквивалентно 0,25 г фецеса) значајно су стимулисали ослобађање ГЛП-1 из примарних ћелија мишјег епитела дебелог црева. Приметно је да је количина ГЛП-1 коју су ослобођиле примарне ћелије мишјег епитела дебелог црева третиране Ф-ДСС-ом била много нижа од оне код примарних ћелија мишјег епитела дебелог црева третираних Ф-Кон и Ф-БЛГ-ом. ћелије епитела дебелог црева (слика 8Б). Ови подаци указују на то да је третман БЛГ значајно обновио производњу ГЛП-1 изведеног из цревних СЦФА.
Слика 8 SCFA изведене из BLG стимулишу ослобађање GLP-1 из примарних ћелија мишјег дебелог црева. (А) Сирћетна киселина, пропионска киселина и бутерна киселина стимулисале су ослобађање GLP-1 из примарних ћелија мишјег дебелог црева; (Б) фекални екстракти F-Con, F-DSS и F-BLG стимулисали су примарне ћелије мишјег дебелог црева. Количина ослобођеног GLP-1. Аликвоти ћелија дебелог црева су стављени у Петријеве шоље са стакленим дном и третирани са 2 mM сирћетне киселине, пропионске киселине, бутерне киселине и фекалних екстракта F-Con, F-DSS и F-BLG (еквивалентно 0,25 г фецеса), респективно. 2 сата на 37°C, 5% CO2, респективно. Количина GLP-1 ослобођеног из примарних ћелија мишјег дебелог црева је детектована ELISA тестом. Подаци су представљени као средња вредност ± SEM (n = 3). #p < 0,05 или ##p < 0,01 у односу на слепу пробу или F-Con; *p < 0,05 у односу на F-DSS.
Скраћенице: Ace, сирћетна киселина; Pro, пропионска киселина; међутим, бутерна киселина; F-Con, фекални екстракт контролних мишева; F-DSS, фекални екстракт мишева са колитисом; F-BLG, из дебелог црева третираног BLG-ом. Фекални екстракти инфламаторних мишева.
Улцерозни колитис, који је Светска здравствена организација навела као резистентну болест, постаје глобална опасност; Међутим, ефикасне методе за предвиђање, спречавање и лечење болести су још увек ограничене. Стога постоји хитна потреба за истраживањем и развојем нових безбедних и ефикасних терапијских стратегија за улцерозни колитис. Препарати традиционалне кинеске медицине су обећавајућа опција јер се показало да су многи препарати традиционалне кинеске медицине ефикасни у лечењу улцерозног колитиса код кинеске популације током векова, а сви су то биолошке органске супстанце и природни материјали који су углавном безопасни за људе и животиње.31,32 Циљ ове студије био је да се пронађе безбедан и ефикасан препарат традиционалне кинеске медицине за лечење улцерозног колитиса и да се истражи његов механизам деловања. БЛГ је добро позната кинеска биљна формула која се користи за лечење грипа.8,33 Рад у нашој лабораторији и другима показао је да индиго, прерађени производ традиционалне кинеске медицине од исте сировине као БЛГ, показује значајну ефикасност у лечењу улцерозног колитиса код људи и животиња.4,34 Међутим, антиколитисни ефекти БЛГ-а и његов механизам нису јасни. У тренутној студији, наши резултати показују да БЛГ ефикасно ублажава упалу дебелог црева изазвану ДСС-ом, која је повезана са модулацијом цревне микробиоте. и обнављање производње ГЛП-1 из црева.
Добро је познато да се улцерозни колитис карактерише рецидивним периодима са типичним клиничким карактеристикама, као што су губитак тежине, дијареја, ректално крварење и опсежно оштећење слузокоже дебелог црева.35 Стога је хронични рецидивни колитис примењен применом три циклуса 1,8% DSS током пет дана, након чега је следило седам дана пијења воде. Као што је приказано на слици 1Б, флуктуирајући губитак тежине и DAI резултати указивали су на успешну индукцију хроничног рецидивног колитиса. Мишеви у групи третираној BLG-ом показали су опоравак од 8. дана, што се значајно разликовало од 24. дана. Исте промене су примећене и у DAI резултатима, што указује на побољшање клиничког побољшања колитиса. У погледу повреде дебелог црева и инфламаторног статуса, дужина дебелог црева, оштећење ткива дебелог црева и експресија гена и производња проинфламаторних цитокина TNF-α, IL-1β и IL-6 у ткиву дебелог црева такође су значајно побољшани након третмана BLG-ом. Заједно, ови резултати јасно показују да је BLG ефикасан у лечењу хроничног рецидивног колитиса код мишева.
Како БЛГ испољава своје фармаколошке ефекте? Бројне претходне студије су показале да цревна микробиота игра кључну улогу у патогенези улцерозног колитиса (УЦ), а терапије засноване на микробиому и усмерене на микробиом појавиле су се као веома атрактивна стратегија за лечење УЦ. У овој студији, показали смо да је третман БЛГ-ом резултирао значајним променама у саставу цревне микробиоте, што сугерише да је заштитни ефекат БЛГ-а против колитиса изазваног ДСС-ом повезан са модулацијом цревне микробиоте. Ово запажање је у складу са идејом да је репрограмирање хомеостазе цревне микробиоте важан приступ разумевању ефикасности ТЦМ препарата.36,37 Приметно је да је Акермансија грам-негативна и строго анаеробна бактерија која живи у слоју слузи црева, која разграђује муцине, производи пропионску киселину, стимулише диференцијацију пехарастих ћелија и одржава функцију интегритета баријере слузокоже.26 Вишеструки клинички и животињски подаци указују на то да је Акермансија у великој мери повезана са здравом слузокожом,38 а орална примена Аккермансија спп. може значајно побољшати упалу слузокоже.39 Наши тренутни подаци указују на то да је релативна количина Akkermansia значајно повећана након третмана BLG-ом. Поред тога, Prevotellaceae_UCG-001 је бактерија која производи SCFA.27 Вишеструке студије су показале да је Prevotellaceae_UCG-001 пронађена у ниској релативној количини у фецесу животиња са колитисом.40,41 Наши тренутни подаци такође показују да третман BLG-ом може значајно повећати релативну количину Prevotellaceae_UCG-001 у дебелом цреву мишева третираних DSS-ом. Насупрот томе, Oscillibacter је мезофилна, строго анаеробна бактерија.42 је известио да је релативна количина Oscillibacter-а значајно повећана код UC мишева и да је значајно позитивно корелирана са нивоима IL-6 и IL-1β и патолошким резултатима.43,44 Приметно је да је третман BLG-ом значајно смањио релативну количину Oscillibacter-а у фецесу мишева третираних DSS-ом. Приметно је да су ове BLG-измењене бактерије биле бактерије које највише производе SCFA. Бројне претходне студије су показале потенцијалне корисне ефекте SCFA. на упалу дебелог црева и заштиту интегритета цревног епитела.45,46 Наши садашњи подаци су такође показали да су концентрације SCFA ацетата, пропионата и бутирата у фецесу третираном DSS-ом биле значајно повећане код мишева третираних BLG-ом. Узети заједно, ови налази јасно показују да BLG третман може ефикасно побољшати DSS-индуковане SCFA бактерије које производе код мишева са хроничним рецидивним колитисом.
ГЛП-1 је инкретин који се углавном производи у илеуму и дебелом цреву и игра важну улогу у одлагању пражњења желуца и снижавању постпрандијалне глукозе у крви.47 Докази указују на то да дипептидил пептидаза (ДПП)-4, агонист ГЛП-1 рецептора, и ГЛП-1 наномедицина могу ефикасно ублажити упалу црева код мишева.48-51 Као што је објављено у претходним студијама, високе концентрације SCFA биле су повезане са нивоима ГЛП-1 у плазми код људи и мишева. 52 Наши тренутни подаци показују да су након третмана БЛГ-ом, нивои ГЛП-1 у серуму и експресија Gcg mRNA значајно повећани. Слично томе, секреција ГЛП-1 је значајно повећана у културама дебелог црева након стимулације фекалним екстрактима мишева са колитисом третираним БЛГ-ом у поређењу са стимулацијом фекалним екстрактима мишева са колитисом третираним ДСС-ом. Како SCFA утичу на ослобађање ГЛП-1? Гвен Толхерст и др. известио је да SCFA могу стимулисати секрецију GLP-1 путем GRP43 и GPR41.29 Наши садашњи подаци такође показују да BLG третман значајно повећава експресију mRNA GRP43 и GPR41 у дебелом цреву мишева третираних DSS-ом. Ови подаци сугеришу да BLG третман може обновити SCFA-промовисану производњу GLP-1 активирањем GRP43 и GPR41.
БЛГ је лек који се дугорочно издаје без рецепта (ОТЦ) у Кини. Максимална толерисана доза БЛГ код мишева из Кунминга је 80 г/кг, и није примећена акутна токсичност.53 Тренутно, препоручена доза БЛГ (без шећера) код људи је 9-15 г/дан (3 пута дневно). Наша студија је показала да БЛГ у дози од 1 г/кг ублажава хронични рецидивни колитис изазван ДСС-ом код мишева. Ова доза је близу дози БЛГ која се користи клинички. Наша студија је такође открила да је његов механизам деловања посредован, барем делимично, променама у цревној микробиоти, посебно бактеријама које производе SCFA, као што су Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001, како би се обновила производња GLP-1 из црева. Ови налази указују на то да БЛГ заслужује даље разматрање као потенцијално терапеутско средство за клиничко лечење колитиса. Међутим, тачан механизам којим модулира цревну микробиоту остаје да се потврди мишевима са недостатком микробиоте и трансплантацијом фекалних бактерија.
Ас, сирћетна киселина; бутирна киселина, бутерна киселина; БЛГ, пандан; ДСС, декстран натријум сулфат; ДАИ, индекс активности болести; ДПП, дипептидил пептидаза; ФИД, детектор пламене јонизације; Ф-Кон, контролни екстракти фекалија мишева; Ф-ДСС, екстракти фекалија мишева са ДСС колитисом; Ф-БЛГ, екстракти фекалија мишева третираних БЛГ-ом; ГЛП-1, глукагон-сличан пептид-1; Гцг, глукагон; гасна хроматографија, гасна хроматографија; ГРП43, рецептор 43 спрегнут са Г протеином; ГРП41, рецептор 41 спрегнут са Г протеином; Х&Е, хематоксилин-еозин; ХБСС, Ханксов уравнотежени раствор соли; ОТЦ, ОТЦ; ПЦА, анализа главних компоненти; ПЦоА, анализа главних координата; Про, пропионска киселина; САСП, сулфасалазин; СЦФА, масне киселине кратког ланца; кинеска медицина, традиционална кинеска медицина; УЦ, улцерозни колитис.
Све експерименталне протоколе одобрио је Комитет за етику животиња Универзитета у Пекингу Шенжен-Хонг Конг Универзитета за науку и технологију (Шенжен, Кина) у складу са Институционалним смерницама и Прописима о животињама (етички број А2020157).
Сви аутори су дали значајан допринос концепцији и дизајну, прикупљању података или анализи и интерпретацији података; учествовали су у изради чланка или критичкој ревизији важног интелектуалног садржаја; сложили су се да пошаљу рукопис актуелном часопису; коначно одобрили верзију за објављивање; били су одговорни за све аспекте рада.
Овај рад је подржала Национална фондација за природне науке Кине (81560676 и 81660479), првокласни пројекат Универзитета у Шенжену (86000000210), Фонд Комитета за иновације у науци и технологији Шенжену (JCYJ20210324093810026) и Фонд за истраживање медицинских наука и технологије покрајине Гуангдонг (A2020157 и A2020272), Фармацеутска кућа Медицинског универзитета Гујџоу провинције Гујџоу коју финансира Кључна лабораторија (YWZJ2020-01) и Болница Шенжен Универзитета у Пекингу (JCYJ2018009).
1. Танг Б, Жу Ј, Жанг Б, и др. Терапеутски потенцијал триптолида као антиинфламаторног средства код експерименталног колитиса изазваног декстран натријум сулфатом код мишева. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Каплан ГГ. Глобални терет ИБД-а: од 2015. до 2025. године. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Пенг Ј, Женг ТТ, Ли Сјуе и др. Алкалоиди биљног порекла: обећавајући модификатори болести код инфламаторних болести црева. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Сјао Хајтенг, Пенг Ђие, Вен Б и др. Indigo Naturalis инхибира оксидативни стрес дебелог црева и Th1/Th17 одговоре код колитиса изазваног DSS-ом код мишева. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Чен М, Динг Ј, Тонг З. Ефикасност и безбедност Софоре флавесценс (Sophora flavescens) кинеске биљне медицине у лечењу улцерозног колитиса: клинички докази и потенцијални механизми. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Цао Фанг, Лиу Ђие, Ша Бенксинг, Пан ХФ. Природни производи: експериментално ефикасни лекови за лечење инфламаторне болести црева. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Жанг Ц, Ђијанг М, Лу А. Размишљања о адјувантном лечењу улцерозног колитиса традиционалном кинеском медицином. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Ли Џонгтенг, Ли Ли, Чен ТТ и др. Ефикасност и безбедност Банланген гранула у лечењу сезонског грипа: протокол студије за рандомизовано контролисано испитивање.trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x