Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да искључите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
За разлику од кичмењака, сматра се да инсекти немају полне стероидне хормоне намењене мушкарцима. Код Anopheles gambiae, екдизонски стероид 20-хидроксиекдизон (20Е) изгледа да је еволуирао да контролише развој јаја када га синтетишу женке2 и да индукује период рефракторности парења када га мужјаци сексуално преносе3. Пошто су развој јаја и парење битне репродуктивне особине, разумевање како женке комараца Anopheles интегришу ове хормонске сигнале могло би олакшати дизајнирање нових програма за контролу маларије. Овде откривамо да су ове репродуктивне функције регулисане различитим полним стероидима кроз сложену мрежу ензима који активирају/инактивирају екдистероиде. Идентификовали смо оксидовани екдизон специфичан за мужјаке, 3-дехидро-20Е (3D20E), који штити родитељство искључивањем женске сексуалне рецептивности након сексуалног преноса и активације дефосфорилацијом. Приметно је да је пренос 3D20Е такође индуковао експресију репродуктивних гена који одржавају развој јаја током инфекције плазмодијумом, осигуравајући здравље заражених женки. 20Е изведен од женки не изазива сексуални одговор, али омогућава јединкама које се паре да полажу јаја након што су инхибиране 20Е-инхибиторне киназе. Идентификација овог мужјачки специфичног инсектицидног стероидног хормона и његова улога у регулисању женске сексуалне рецептивности, плодности и интеракције са плазмодијумом сугерише потенцијал за смањење репродуктивног успеха комараца који преносе маларију.
Случајеви и смртни случајеви маларије поново су у порасту4 због широко распрострањене резистенције на инсектициде код комараца Anopheles, јединог вектора људских паразита маларије. Биологија парења ових комараца је посебно атрактивна мета за нове интервенције контроле маларије, јер се женке паре само једном5; стерилност овог једног парења имала би велики потенцијал за смањење популације комараца на терену.
Жене постају сексуално неспособне након што приме стероидне хормоне високог титра од мушкараца. Студије су показале да је окидач за тешкоће у даљем парењу 20-хидроксиекдизон (20Е), стероидни хормон познатији као регулатор циклуса митарења у ларвалној фази. Способност мужјака да синтетишу и преносе 20Е еволуирала је посебно код врста Anopheles које су део подрода Cellia7, који је распрострањен у Африци и укључује најопасније векторе маларије, укључујући Anopheles gambiae. Ово је посебно вредно пажње јер код ових врста женке такође производе 20Е након сваког оброка крви, а 20Е покреће циклус оогенезе (видети реф. 8). Међутим, мало се зна о начину на који женке интегришу сигнале из два различита извора екдизона (пренос мужјака и индукција храњења крви) без угрожавања сопствене способности парења. У ствари, ако 20Е који производе женке покрене сексуалну нетолеранцију, то ће довести до неплодности код јединки које се хране девственицама, што је веома често понашање код ових комараца5.
Могуће објашњење је да мужјаци A. gambiae преносе модификовани мужјачки специфичан екдизон, који активира сигналну каскаду у женском репродуктивном тракту, што доводи до нестабилности парења. Међутим, иако кичмењаци имају више стероидних хормона, као што су естроген и андроген (прегледано у реф. 9), колико нам је познато, стероиди изазвани андрогеним дејством нису идентификовани код инсеката.
Кренули смо да утврдимо репертоар стероидних хормона у мушкој помоћној жлезди (MAG) полно зреле јединке A. gambiae у потрази за могућим модификујућим стероидима. Користећи високоефикасну течну хроматографију у комбинацији са тандемском масеном спектрометријом (HPLC-MS/MS) уместо мање специфичне методе која је раније коришћена, детектовали смо екдизон (Е) и 20Е у овом ткиву, потврђујући претходни резултат. Међутим, узорак је био доминиран оксидованим фосфорилисаним стероидима, у складу са формулом 3-дехидро-20Е-22-фосфат (3D20E22P)12 (Слика 1). Други облици укључују 3-дехидро-20Е (3D20E) и 20Е-22-фосфат (20E22P). Интензитет HPLC-MS/MS сигнала 3D20E22P био је два реда величине већи од његовог дефосфорилисаног облика, 3D20E, и три реда величине већи од Е и 20Е (Слика 1). Иако је у другим деловима тела и доњем репродуктивном тракту... (LRT; Проширени подаци, сл. 1а). Такође смо анализирали екдистероиде код новозатворених (<1 дан старих) мужјака и женки и открили 3D20E и 3D20E22P само у MAG; E, 20E и 20E22P били су присутни код оба пола (Проширени подаци, сл. 1б). Ови подаци указују на то да одрасли мужјаци A. gambiae производе високе титре модификујућих хормона у својим MAG које женке не синтетишу.
МАГ и женски ЛРТ (укључујући преткоморе, семене кесице и пароваријум) су дисецирани од 4 дана старих (4 дана старих) девичанских мужјака и девичанских и парених женки (0,5, 3 и 12 hpm). Екдизон у овим ткивима је анализиран помоћу ХПЛЦ-МС/МС (средња вредност ± сема вредност; неупарени t-тест, двострани, коригована стопа лажног откривања (FDR); НС, није значајно; *П < 0,05, **П < 0,01). 3Д20Е: 3 сата у односу на 0,5 сати, П = 0,035; 12 сати у односу на 3 сата, П = 0,0015; 12 сати у односу на 0,5 сати, П = 0,030. 3Д20Е22П: 3 сата у односу на 0,5 сати, П = 0,25; 12 сати у односу на 3 сата, П = 0,0032; 12 сати у односу на 0,5 сати, P = 0,015). Подаци су из три биолошка понављања. Површина пика за сваки екдизон од интереса је израчуната и нормализована бројем комараца. Екдизон је представљен следећим бојама: E, зелена; 20E, наранџаста; 20E22P, љубичаста; 3D20E, плава; 3D20E22P, ружичаста. Уметнути део повећава скалу на y-оси да би приказао ниже нивое екдизона.
Да бисмо истражили да ли се 3D20E22P и 3D20E преносе током парења, сецирали смо женске БРТ у различитим временским тачкама након парења. Иако екдизон није пронађен код девица, приметили смо значајне количине 3D20E22P у БРТ одмах након парења (0,5 сати након парења, hpm), које су се временом смањивале, док су се нивои 3D20E значајно повећавали (Сл. 1). Користећи хемијски синтетизовани 3D20E као стандард, утврдили смо да су нивои овог стероидног хормона у БРТ током парења били најмање 100 пута већи од 20E (Проширена табела података 1). Дакле, 3D20E22P је главни мушки екдизон који се преноси на женске БРТ током парења, а његов дефосфориловани облик, 3D20E, постаје веома заступљен убрзо након парења. Ово указује на важну улогу овог другог екдизона у биологији женки након парења.
Након генерисања новог скупа података о секвенцирању РНК (RNA-seq) (Сл. 2а), користећи прилагођени биоинформатички цевовод, тражили смо екдизон киназу (EcK), екдизон оксидазу (EO) и екдизон који кодира ген 20E-модификоване фосфатазе. EPP) се експресује у репродуктивним ткивима. Идентификовали смо једног кандидата за EPP ген и два потенцијална EcK гена (EcK1 и EcK2), али нисмо успели да пронађемо доброг кандидата за EO ген. Приметно је да су појединачни EPP гени били експресовани на високим нивоима (98,9. перцентил) у гамбијским MAG, али не и у женским LRT (Сл. 2б), супротно нашим очекивањима, јер се дефосфорилација 3D20E22P догодила у овом женском ткиву. Стога верујемо да се мушки EPP може пренети током парења. Заиста, користили смо in vivo обележавање стабилним изотопима да бисмо маскирали женски протеин након парења, ензим који је MS идентификовао у женској преткомори (Сл. 2ц и Додатна табела 1). Присуство ЕПП код МАГ и парених (али не и девичанских) женских ЛРТ је такође потврђен коришћењем специфичних антитела (Сл. 2д).
а, Прилагођени биоинформатички цевовод за претрагу репродуктивних ткива сваког пола у потрази за генима који кодирају EcK, EO и EPP. Бројеви поред стрелица означавају број мушких и женских кандидата у сваком кораку. Ова анализа је идентификовала један EPP ген (EPP) и један EcK ген (EcK1) који се експресују код мужјака, и један EcK ген (EcK2) који се експресује код оба пола, али не даје кандидатски EO ген.б, Топлотна мапа која упоређује експресију кандидатских гена у девичанским (V) и парећим (M) ткивима Anopheles gambiae и Anopheles albicans. Spca, оплодња; MAG, помоћне жлезде код мужјака; други делови тела, укључујући груди, крила, ноге, масна тела и унутрашње органе код оба пола, и јајнике код женки. EcK2 је високо експресован и у MAG и у преткоморама Гамбије, док се EPP налази само у MAG.c, Протеомска анализа транслокације групе мушког ејакулата у женске преткоморе на 3, 12 и 24 hpm, показујући 67 најзаступљенијих протеина. Женке су одгајане на дијети која садржи 15N да би се обележили (и маскирали) сви протеини. Неозначени мужјаци су парени са означеним женкама, а женске LRT су дисециране на 3, 12 и 24 hpm за протеомску анализу (видети Додатну табелу 1 за комплетну листу ејакулаторних протеина). Уметнути део, EPP, Eck1 и EcK2 су детектовани у MAG неозначених мужјака протеомском анализом ових ткива.d, EPP је детектован Western blot-ом у MAG и LRT парених женки, али не код неозначених женки или мужјака или остатка женског тела. Мембране су истовремено тестирано са анти-актином (контрола пуњења) и анти-EPP антителима. Сви мужјаци су девици. Видети Додатну слику 1 за податке о извору гела. Вестерн блот анализе су извршене два пута са сличним резултатима.
Екдистероидна фосфофосфатазна активност EPP је верификована након инкубације HPLC-MS/MS са 3D20E22P изолованим из MAG (Проширени подаци, слика 2а). Штавише, када смо утишали EPP РНК-посредованом интерференцијом (RNAi), открили смо снажно смањење активности фосфатазе у репродуктивним ткивима ових мужјака (слика 3а), а женке парене са мужјацима којима је утишан EPP показале су значајно нижи удео дефосфорилисаног 3D20E (слика 3б) упркос делимичном утишавању гена (Проширени подаци, слика 2б,ц). Насупрот томе, нисмо открили значајне промене у односу 20E22P/20E код истих комараца, што би могло сугерисати да је ензим специфичан за 3D20E22P (слика 3б).
а, Смањена активност фосфатазе у MAG узрокована утишавањем EPP-а коришћењем контрола дволанчане EPP РНК (dsEPP) или дволанчане GFP РНК (dsGFP). Двадесет MAG базена је коришћено у свакој репликацији (P = 0,0046, упарени t-тест, двострани), представљених одвојеним тачкама.б, Женке парене са мужјацима са утишаним EPP-ом имале су значајно мањи удео дефосфорилисаног 3D20E на 3 hpm (P = 0,0043, неупарени t-тест, двострани), док нивои 20E нису били погођени (P = 0,063, неупарени). t-тест, двострани). Подаци су представљени као средња вредност ± семеновредна вредност из три групе од по 13, 16 и 19 женки.c, Женке парене са мужјацима којима је утишан EPP имале су значајно веће стопе поновног парења (P = 0,0002, Фишеров тачан тест, двострани). Женке су прво биле приморане да се паре како би се осигурао њихов статус парења; Два дана касније, контактирани су са другим мужјацима који су носили трансгену сперму како би се проценила стопа поновног парења квантитативном ПЦР детекцијом трансгена.d, Женке храњене крвљу, парене са мужјацима којима је утишан ЕПП, имале су значајно смањену плодност (P < 0,0001; Ман-Витнијев тест, двострани) и благо смањен број јаја (P = 0,088, Ман-Витнијев тест, двострани), док стопа мрешћења није била погођена (P = 0,94, Фишеров тачан тест, двострани). У свим панелима, n представља број биолошки независних узорака комараца.NS, није значајно.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Затим смо проценили да ли је дефосфорилација екдизона важна за индуковање отпора према парењу код женки. Приметно је да су се женке које су се париле са мужјацима са смањеним нивоом ЕПП-а поново париле са много већом учесталошћу (44,9%) него контролне женке (10,4%) када су биле изложене додатним (трансгеним) мужјацима (Сл. 3ц). Такође смо приметили значајно смањење плодности (Сл. 3д, лево) и благо смањење броја јаја које су положиле ове женке (Сл. 3д, средина), док проценат јаја које су положиле женке (још један одговор изазван код женки парењем) није био погођен (Сл. 3д, десно). С обзиром на уочену специфичност ЕПП-а за 3Д20Е22П, ови резултати сугеришу да активација 3Д20Е помоћу ЕПП-а пренетог током парења може имати важну улогу у искључивању женске рецептивности за даље парење, понашање које се раније приписивало сексуалном преносу 20Е. Стога, овај хормон специфичан за мушкарце такође снажно утиче на женску плодност.
Затим смо упоредили активности 20Е и 3Д20Е у експериментима ињекције код полно зрелих девица користећи хемијски синтетизовани 3Д20Е (Сл. 4а–ц) и комерцијално доступан 20Е. Приметили смо да је 3Д20Е био значајно ефикаснији од 20Е у искључивању осетљивости женки на парење при обе концентрације (Сл. 4д). Приметно је да је половина физиолошког нивоа 3Д20Е у ЛРТ ​​(1.066 пг након ињекције у односу на 2.022 пг након парења) изазвала пропорцију резистентних женки која је била 20 пута већа од физиолошког нивоа 20Е (361 пг након ињекције) 24 сата након ињекције при највишој концентрацији од 18 пг након парења; Проширени подаци (Табела 1). Овај резултат је у складу са идејом да сексуални пренос 20Е не изазива рефракторне периоде парења и додатно указује на 3Д20Е као главни фактор у осигуравању односа родитељ-дете. 3Д20Е је такође био значајно активнији од 20Е у тестовима полагања јаја код девичанских женки (Сл. 4е), што сугерише да је нормална стопа полагања јаја коју смо приметили након делимичног утишавања ЕПП-а била последица присуства резидуалне 3Д20Е активности коју и даље производе фактори изазвани парењем код женки.
(а, б) 3Д20Е хемијски синтетисан из 20Е (а) са веома високом конверзијом/ефикасношћу (подаци представљени као средња вредност ± семеновредност из три независне реакције синтезе) (б).ц, Масени спектар (доња половина) тачно се поклапа са екдизоном пронађеним код парених женских ЛРТ (горња половина).д, У поређењу са 20Е (0,63 µг, П = 0,02; 0,21 µг, П < 0,0001; Фишеров тачан тест, двострани) и 10% етанолом (0,63 µг, П < 0,0001; 0,21 µг, П < 0,0001; Фишеров тачан тест, двострани), док је 20Е био значајно већи од контроле само при вишим дозама (0,63 µг, П = 0,0002; 0,21 µг, П = 0,54; Фишеров тачан тест, двострани).е, ињекција 3Д20Е је изазвала значајно веће стопе мрешћења код девичанских женки него код контрола са 10% етанола (0,21 µг, P < 0,0001; 0,13 µг, P = 0,0003; Фишеров тачан тест, двострани), док је 20Е у поређењу са контролама само при вишим дозама (0,21 µг, P = 0,022; 0,13 µг, P = 0,0823; Фишеров тачан тест, двострани).3Д20Е је индуковао значајно веће стопе мрешћења него 20Е при вишим дозама (0,21 µг, P = 0,0019; 0,13 µг, P = 0,075; Фишеров тачан тест, двострани). У свим панелима, n представља број биолошки независних узорака комараца.NS, није значајно.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Подаци су из три реплике.
У претходним студијама, утврдили смо да сексуални пренос стероидних хормона индукује експресију MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), женског репродуктивног гена који штити женке A. gambiae од инфекције P. falciparum. Здравствени трошкови изазвани 13, најсмртоноснијим људским паразитом маларије. С обзиром на важност MISO за репродуктивну способност Anopheles-а у подручјима ендемским за маларију, одлучили смо да утврдимо који хормон 3D20E или 20E покреће експресију овог гена. Открили смо да, иако је ињекција 20E специфично или снажније индуковала неке нуклеарне хормонске рецепторе (HR), као што су HR3 и HR4, и типичне низводне стероидне мете, као што су јолкогени гени Vg14, 15, 16, MISO је био снажније индукован помоћу 3D20E (Проширени подаци, слика 3). Дакле, сексуални пренос овог андрогеног стероидног хормона изгледа индукује механизме који штите женке од трошкова које представља паразитска инфекција. Штавише, 3D20E различито утиче на обе изоформе Е рецептор EcR, индукујући EcR-A и потискујући EcR-B, и снажније покрећући друге гене који индукују парење, укључујући HPX15, што утиче на женску плодност. Ово би могло да објасни значајну неплодност примећену код женки парених са мужјацима са утишаним EPP-ом (Проширени подаци, слика 3). Ови подаци указују на постојање низводних путева преференцијално активираних два екдизонска хормона који могу бити у основи полно специфичне функције.
Затим смо тестирали функцију два EcK гена идентификована у нашем биоинформатичком цевоводу. Утишавање EcK1 или EcK2 резултирало је значајним морталитетом код мужјака (Проширени подаци, слика 4а), што сугерише да је фосфорилација екдизона, а самим тим и инактивација, важна за преживљавање. Пошто је EcK2 био експримиран на вишим нивоима од EcK1 и детектован је у MAG-овима протеомиком (слика 2б,ц и додатна табела 2), потврдили смо његову активност екдистероид киназе инкубирањем са 20Е, што је резултирало фосфорилацијом 20Е22П (Проширени подаци, слика 2).4б). Када смо користили 3D20E као супстрат, нисмо били у могућности да детектујемо фосфориловани производ 3D20Е22П (Проширени подаци, слика 4ц), што сугерише да би 20Е, а не 3D20E, могао бити преферирана мета EcK2.
Према нашој РНК-секвенционој анализи, EcK2 је такође био високо експресован у ЛРТ-у девичанских женки, где је био искључен након парења (Сл. 2б). Потврдили смо ове податке и утврдили да експресија EcK2 није била погођена исхраном крви (Проширени подаци, Сл. 5а). Проширујући наше почетне МС експерименте, утврдили смо да је врх 20E22P био уско повезан са врхом 20E (22-26 сати након оброка са крвљу; Проширени подаци, Сл. 5б). Утишавање EcK2 код девичанских женки резултирало је троструким повећањем релативног односа 20E према 20E22P 26 сати након оброка са крвљу (Проширени подаци, Сл. 2ц и 5ц), потврђујући да EcK2 такође фосфорилује 20E код женки. Приметно је да су девичанске женки са смањеним нивоом EcK2 задржале пуну сексуалну рецептивност (Проширени подаци, Сл. 5д,е), што додатно сугерише да производња 20E код женки не индукује рефракторне периоде парења. Међутим, ове женке су имале значајно... повећане стопе полагања јаја у поређењу са контролама, са више од 30% девица које су положиле јаја (Проширени подаци, слика 5ф). Ако су ињекције дволанчане Eck2 РНК (dsEcK2) извршене након храњења крвљу, мрест није дошао, у ком тренутку је врх 20E услед уноса крви опао. Генерално, ови резултати подржавају модел да 20E произведен након сисања крви може изазвати мрест, али само када је блок мреста (EcK2 и могуће други фактори) искључен парењем. Ни ињекције 20E ни 3D20E нису инхибирале експресију EcK2 код девица (Проширени подаци, слика 5г), што сугерише да други фактори посредују у инхибицији ове киназе. Међутим, нивои 20E након храњења крвљу нису били довољни да изазову нелагодност при парењу, већ су их ефикасно покренули високи титри сексуално пренетог 3D20E.
Наши резултати пружају важан увид у механизме који регулишу репродуктивни успех A. gambiae. Појавио се модел где су мужјаци еволуирали да синтетишу високе титре 3D20E, мужјачки специфичног модификованог екдизона који осигурава родитељство десензибилизацијом женки за даље парење. Истовремено, ови вектори маларије су такође развили ефикасан систем за активирање 3D20E код женки као одговор на сексуални пренос мужјачки специфичног EPP-а. Колико нам је познато, ово је први пример система стероидних хормона којим доминирају мужјаци и женка, а који обавља јединствену и критичну функцију код инсеката. Мужјачки специфична функција екдизона је постулирана, али није дефинитивно доказана. На пример, углавном оповргнута хипотеза 18 је да ове функције може обављати прекурсор 20E E1. Добро је познато да се код Drosophila монандрија покреће сексуалним преносом малих полних пептида 19,20 који интерагују са неуронима који инервишу женски репродуктивни тракт путем специфичних рецептора полних пептида 21,22. Потребан је даљи рад како би се одредиле низводне сигналне каскаде. контролисано помоћу 3D20E код женки A. gambiae и да се утврди да ли се ове каскаде могу очувати између комараца и Drosophila.
С обзиром на важну улогу 3D20E на плодност и понашање женки идентификовану у нашој студији, путеви који воде до синтезе и активације 3D20E нуде нове могућности за будуће стратегије контроле комараца, као што је стварање конкурентних стерилних мужјака у стратегијама технологије стерилних инсеката који се користе за пуштање у дивљину или за имитацију 3D20E у игри без детета. Функција 3D20E специфична за мужјаке можда је еволуирала када су A. gambiae и друге врсте Cellia стекле способност да коагулирају своју сперму у чепове за парење, јер то омогућава ефикасан пренос великог броја хормона и ензима који активирају хормоне. Заузврат, еволуција 3D20E имплементацијом монандрије пружа механизам за женке (кроз високу експресију MISO) да фаворизује своју репродуктивну способност у подручјима са високом преваленцијом маларије, што индиректно доприноси преносу Plasmodium-а. С обзиром на то да је показано да женски 20E има дубок утицај на преживљавање и раст P. falciparum код женки комараца Anopheles,24 и мушки и женски путеви стероидних хормона сада су кључни аспекти интеракција комараца и паразита.
Сојеви A. gambiae G3 су узгајани под стандардним условима за инсекте (26-28 °C, релативна влажност 65-80%, фотопериод светлости/таме 12:12 сати). Ларве су храњене прашкастом храном за рибе (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets и Tetra Pond Sticks у односу 7:7:2). Одрасли комарци су храњени ad libitum 10% раствором декстрозе и недељно људском крвљу (компоненте крви за проучавање). Девичарски комарци су добијени раздвајањем полова у фази лутке након прегледа крајева микроскопијом. Мужјаци који носе DsRed трансген су претходно описани.
Експерименти присилног парења су спроведени према претходно описаним протоколима. За природно парење, женке старе 4 дана држане су у односу 1:3 са полно зрелим мужјацима током две ноћи. За експерименте у којима је мужјацима убризган dsEPP, заједнички смештај у кавезу поклопио се са 3-4 дана након убризгавања, када је активност фосфатазе била максимално утишана (Проширени подаци, слика 2б).
Ткива комараца, преостали лешеви (остатак тела) или цело тело су дисецирани у 100% метанолу и хомогенизовани помоћу куглице (стаклене перле од 2 мм, 2.400 о/мин, 90 секунди). Количине ткива и запремине метанола биле су следеће: остатак тела, 50 у 1.000 µl; MAG, 50–100 по 80 µl; женски LRT, 25–50 по 80 µl. Талог је подвргнут другој екстракцији метанолом са истом запремином метанола. Ћелијски остаци су уклоњени центрифугирањем. Метанол из обе екстракције је комбинован и осушен под протоком азота, а затим ресуспендован у следећим запреминама 80% метанола у води: остатак тела, 50 µl; MAG и женски LRT, 30 µl.
Узорци су анализирани на масеном спектрометру (ID-X, Thermo Fisher) повезаном са LC инструментом (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl узорка је убризгано на колону од 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) одржавану на 25 °C. Мобилне фазе за LC биле су A (вода, 0,1% мравља киселина) и B (ацетонитрил, 0,1% мравља киселина). LC градијент је био следећи: 5% B током 1 минута, затим повећан на 100% B током 11 минута. Након 8 минута на 100%, поново уравнотежити колону на 5% B током 4 минута. Брзина протока је била 0,3 ml min-1. Јонизација у MS извору се постиже загревањем електроспреј јонизацијом у позитивном и негативном режиму.
Масени спектрометар мери податке у m/z опсегу од 350 до 680 при резолуцији од 60.000 у пуном MS режиму. MS/MS подаци су прикупљени на [M + H]+ (све мете), [M - H2O + H]+ (све мете) и [M - H]- (фосфорилисане мете). MS/MS подаци су коришћени за потврду екдизонских својстава мета за које није био доступан стандард. Да би се идентификовали нециљани екдистероиди, анализирани су MS/MS подаци за све HPLC пикове са релативном количином >15%. Квантификујте користећи стандардне криве креиране од чистих стандарда (20E, 3D20E) да бисте израчунали апсолутне количине или разблажења једног специфичног узорка (све остале мете) да бисте израчунали њихову еквивалентност количинама пронађеним код једног мужјака. За 3D20E, квантификација је извршена коришћењем збира следећих адукта: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Подаци су екстраховани и квантификовани коришћењем програма Tracefinder (верзија 4.1).MS/MS подаци су анализирани коришћењем програма Xcalibur (верзија 4.4).MS спектри E, 20E и 3D20E су упоређени са одговарајућим стандардима. 3D20E22P је анализиран дериватизацијом помоћу Жирардовог реагенса. 20E22P је анализиран односом m/z.
3D20E22P је пречишћен из MAG-а. Пречишћавање је извршено на аналитичкој скали коришћењем ултра-перформансног течног хроматографа (Acquity, Waters) са квадруполним детектором заснованим на маси (QDa, Acquity, Waters) под истим LC условима као и HPLC-MS/MS анализа. Сакупљање фракција је покренуто када је m/z који одговара 3D20E22P детектован у истом времену задржавања као што је претходно одређено. Чистоћа екстрахованих једињења је затим проверена HPLC-MS/MS као што је горе описано.
Укупна РНК је екстрахована из 10-12 репродуктивних ткива или других делова тела (без главе) коришћењем TRI реагенса (Thermo Fisher) пратећи упутства произвођача. РНК је третирана са TURBO DNase (Thermo Fisher). цДНК је синтетисана коришћењем реверзне транскриптазе Moloney вируса мишје леукемије (M-MLV RT; Thermo Fisher) пратећи упутства произвођача. Прајмери ​​за квантитативну PCR са реверзном транскрипцијом (RT-qPCR; Extended Data Table 2) су претходно објављени24 или дизајнирани коришћењем Primer-BLAST26, при чему је предност дата производима величине 70-150 bp и који обухватају спојеве ексон-ексон или прајмере паром прајмера који одвајају ексоне. Узорци цДНК из три до четири биолошка репликата су разблажени четири пута у води за RT-qPCR. Квантификација је извршена у реакцијама репликата од 15 µl које су садржале 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), прајмере и 5 µl разблажене цДНК. Реакције су спроведене на QuantStudio 6 Pro систему за PCR у реалном времену (Thermo Фишер) и подаци су прикупљени и анализирани коришћењем програма Design and Analysis (верзија 2.4.3). Као што је показано у овој студији, релативне количине су нормализоване на рибозомални ген RpL19 (AGAP004422), чија се експресија није значајно мењала са храњењем крвљу 27 или парењем 3.
Квалитет РНК је проверен помоћу Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer-а (Agilent). Illumina библиотеке упарених крајева су припремљене и покренуте на Broad институту МИТ-а и Харварда. Секвенцирана очитавања су поравната са геномом A. gambiae (PEST сој, верзија 4.12) коришћењем HISAT2 (верзија 2.0.5) са подразумеваним параметрима. Очитавања са резултатима квалитета мапирања (MAPQ) <30 су уклоњена коришћењем Samtools-а (верзија 1.3.1). Број очитавања мапираних на гене је избројан коришћењем htseq-count (верзија 0.9.1) са подразумеваним параметрима. Нормализовани бројеви очитавања су израчунати, а диференцијална експресија гена анализирана коришћењем DESeq2 пакета (верзија 1.28.1) у R-у (верзија 4.0.3).
Кандидати за гене који модификују екдизон идентификовани су првобитно претраживањем генома A. gambiae коришћењем PSI-BLAST алгоритма (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), користећи подразумеване вредности параметара са следећим секвенцама протеина упита: из Bombyx mori (број приступа NP_001038956.1), Musca domestica (број приступа XP_005182020.1, XP_005175332.1 и XP_011294434.1) и Microplitis demolitor (број приступа XP_008552646.1 и XP_008552645.1) EcK из B. mori (број приступа NP_001036900), Drosophila melanogaster (број приступа NP_651202), Apis mellifera (број приступа XP_394838) и Acyrthosiphon pisum (број приступа XP_001947166); и EPP од B. mori (број приступа XP_001947166) NP_001177919.1 и NP_001243996.1) и EO од D. melanogaster (број приступа NP_572986.1) (корак 1). Затим, филтрирајте поготке на основу високе експресије мРНК (>100 фрагмената/килобазних ексона на милион мапираних очитавања (FPKM) или >85%) у репродуктивном ткиву (женски LRT или MAG) у Гамбији (корак 2). Да бисмо побољшали специфичност, одабрали смо кандидатске ензиме који се такође експресују у репродуктивном ткиву A. albimanus, врсте Anopheles која не синтетише нити преноси екдизон током парења. Кандидатски гени су филтрирани на основу ниске експресије (<100 FPKM или <85. перцентил) у репродуктивном ткиву A. albimanus (корак 3). Као коначни филтер (корак 4), кандидатски гени морају да задовоље барем један од следећих услова: (1) значајно повећана експресија након парења (P < 0,05) према анализи диференцијално експресованих гена и (2) у нерепродуктивним ткивима (< 85% или <100 FPKM).
Модификовали смо претходно описане методе 28, 29, 30 како бисмо постигли изотопско обележавање целог организма. Укратко, дивљи тип Saccharomyces cerevisiae типа II (YSC2, Sigma) је тестиран у квасчевој азотној бази (BD Difco, DF0335) која садржи (теж./вол.) 2% глукозе (G7528, Sigma), 1,7% медијума за култивацију без аминокиселина и амонијум сулфата и 5% 15N амонијум сулфата (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) као једини извор азота. Квасац је регенерисан центрифугирањем, а ларве комараца су храњене ad libitum до улуткања. Додатак је рибље брашно (0,5 мг на 300 ларви) како би се спречила смртност у четвртом инстару. Само су женке затим коришћене у експериментима парења са необележеним мужјацима ради анализе мужјачког протеома пренетог током парења.
Женке старе 4-6 дана, означене са 15N-ом, биле су приморане да се паре са мужјацима без ознака, одговарајуће старости. Успешно парење је верификовано детекцијом чепова за парење под епифлуоресцентном микроскопијом. У 3, 12 и 24 сата у минути, преткоморе 45-55 парених женки су дисециране у 50 µl амонијум бикарбонатног пуфера (pH 7,8) и хомогенизоване тучком. Хомогенат је центрифугиран, а супернатант помешан са 50 µl 0,1% RapiGest-а (186001860, Waters) у 50 mM амонијум бикарбонату. Супернатант и талог из сваког узорка су брзо замрзнути на сувом леду и послати преко ноћи у MacCoss лабораторију на Универзитету у Вашингтону, где је завршена припрема узорка за LC-MS/MS. Талог је ресуспендован у 50 µl 0,1% RapiGest-а у 50 mM амонијум бикарбонату и сонициран у воденом купатилу. Концентрација протеина у талогу и супернатанту је мерена BCA методом. У тесту, узорци су редуковани са 5 mM дитиотреитола (DTT; Sigma), алкиловани са 15 mM јодоацетамида (Sigma) и инкубирани на 37 °C (1:0 50) током 1 сата са односом трипсинизација:трипсин:супстрат). RapiGest је лизиран додатком 200 mM HCl, након чега је следила инкубација на 37 °C током 45 минута и центрифугирање на 14.000 rpm током 10 минута на 4 °C ради уклањања остатака. Узорци су испрани двомодном екстракцијом на чврстој фази (Oasis MCX кертриџи, Waters) и ресуспендовани у 0,1% мрављој киселини до коначне концентрације протеина од 0,33 µg µl-1. Необележени MAG протеоми су слично анализирани код дериватних мужјака. Два аналитичка репликата су анализирана за сваки узорак. Затим, 1 µg сваког је анализиран коришћењем колоне од 75 μm од фузионог силицијума од 25 cm са 4 cm... Трапка од фрита од фузионог силицијум диоксида Kasil1 (PQ) пуњена обрнуто-фазном смолом Jupiter C12 (Phenomenex) и течна хроматографија у трајању од 180 минута. Разлагање узорака – MS/MS је спроведен на Q-Exactive HF масеном спектрометру (Thermo Fisher) са nanoACQUITY UPLC системом (Waters). Подаци о аквизицији генерисани за свако мерење конвертовани су у mzML формат коришћењем Proteowizard-а (верзија 3.0.20287) и коришћењем Comet31 (верзија 3.2) у односу на FASTA базу података која садржи протеинске секвенце из Anopheles gambiae (VectorBase верзија 54), Anopheles coluzzi. Претрага је извршена на Mali-NIH (VectorBase верзија 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, март 2021), A. gambiae RNA-seq и транслацијама три фрејма познатих људских загађивача. FDR-ови упарени са пептидном мапом одређени су коришћењем Percolator32 (верзија 3.05) са прагом од 0,01, а пептиди су састављени у протеинске идентификације коришћењем штедње протеина у Limelight33 (верзија 2.2.0). Релативна заступљеност протеина процењена је коришћењем нормализованог фактора спектралне заступљености (NSAF) израчунатог за сваки протеин у сваком покушају као што је претходно описано. NSAF у односу на сваки протеин усредњен је за узорке из две различите биолошке реплике. Обележавање са 15N успешно је маскирало женски протеом, иако је мала количина необележеног протеина могла бити детектована из обележених девичанских узорака. Забележили смо детекцију смањења мушких протеина (1-5 спектри) у сировим женским узорцима само у техничким покушајима, где су сирови узорци анализирани након мушких/парећих узорака, као резултат „преношења“ HPLC методом. Повремени протеини пронађени као „контаминанти“ из обележених девичанских узорака наведени су у Додатној табели 1.
Два антигена пептида, QTTDRVAPAPDQQQ (унутар изотипа PA) и MESDGTTPSGDSEQ (унутар изотипа PA и PB) у Genscript-у. Два пептида су комбинована, затим конјугована са носачким протеином KLH и убризгана у новозеландске зечеве. Зечеви су жртвовани након четврте ињекције, а укупни IgG је изолован афинитетним пречишћавањем. IgG од зеца најспецифичнијег за EPP је коришћен за даљи вестерн блотинг.
За вестерн блот, MAG (n = 10, где n представља број биолошки независних узорака комараца) и женски LRT (n = 30) од 4 дана старих мужјака и девичанских или присилно парених женки (<10 након парења), пуфер за екстракцију протеина (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% натријум деоксихолат; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× коктел инхибитора протеазе (Roche)) је додат одвојено. Узорци су хомогенизовани одмах након дисекције помоћу перлице (стаклене перле од 2 mm, 2.400 о/мин, 90 секунди). Нерастворљиви остаци су уклоњени центрифугирањем на 20.000 g на 4 °C. Протеини су квантификовани Bradford тестом (Bio-Rad). Затим је 20 µg MAG протеина, 40 µg LRT протеина и 20 µg резидуалног протеина денатурисано и раздвојено са 10%. Бис-Трис НуПАГЕ коришћењем МОПС пуфера. Протеини су пренети на поливинилиден флуоридне мембране коришћењем iBlot2 система за пренос (Thermo Fisher). Мембране су испране два пута у 1× PBS-T (0,1% Tween-20 у PBS) и затим блокиране у Odyssey блокирајућем пуферу (Li-Cor) током 1 сата на 22°C. Мембране су мућкане преко ноћи на 4°C са прилагођеним зечјим анти-EPP поликлонским примарним антителом (1:700 у блокирајућем пуферу) и пацовским анти-актин моноклонским примарним антителом MAC237 (Abeam; 1:4.000). Мембране су испране са PBS-T, а затим инкубиране са секундарним антителима (магарећим анти-зечјим 800CW и козјим анти-пацовским 680LT (Li-Cor), оба 1:20.000) у блокирајућем пуферу који садржи 0,01% SDS и 0,2% Tween-20 током 1 сата на 22°C. Мембране су испране са PBS-T. и снимљено помоћу Odyssey CLx скенера. Слике су прикупљене и обрађене у програму Image Studio (верзија 5.2). Специфична трака која одговара EPP-RA изоформи (82 kDa) није детектована.
Кодирајући региони EPP (као изоформа AGAP002463-RB која садржи домен хистидин фосфатазе, NCBI претрага конзервираног домена 34) и EcK2 (AGAP002181) су клонирани у плазмид pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); прајмери ​​су наведени у проширеној табели података 2. Осам GS4 линкера (у тандему) је уметнуто пре C-терминалне 6xHis ознаке конструкције pET-21a(+)-EcK2. Рекомбинантни протеини су произведени коришћењем NEBExpress реакције синтезе протеина E. coli без ћелија (New England BioLabs). Рекомбинантни протеини су пречишћени коришћењем NEBExpress Ni спин колона (New England BioLabs). Контролни протеин дихидрофолат редуктазе (DHFR) је произведен коришћењем ДНК шаблона из NEBExpress комплета за синтезу протеина E. coli без ћелија. Протеини су чувани у 50% глицеролу у PBS на -20 °C до 3 месеца.
Фосфатазна активност EPP и екстраката ткива мерена је коришћењем 4-нитрофенил фосфата (pNPP; Sigma-Aldrich). Реакциони пуфер је садржао 25 mM Tris, 50 mM сирћетне киселине, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA и 1 mM DTT. Ткиво је хомогенизовано у реакционом пуферу, а ћелијски остаци су уклоњени центрифугирањем. Реакцију започети додавањем ензима или екстракта ткива у реакциони пуфер који садржи 2,5 mg ml-1 pNPP. Реакциона смеша је инкубирана на собној температури у мраку, а количина pNP конвертована из pNPP је квантификована мерењем апсорбанције на 405 nm у различитим временима.
За in vitro EcK активност, протеин је инкубиран са 0,2 мг 20Е или 3Д20Е у 200 µл пуфера (pH 7,5) који садржи 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP и 10 mM MgCl2 током 2 сата на 27 °C. Реакција је заустављена додавањем 800 µл метанола, затим хлађена на -20 °C током 1 сата, а затим центрифугирана на 20.000 g током 10 минута на 4 °C. Супернатант је затим анализиран HPLC-MS/MS. Да би се протеини коришћени у контролној групи инактивирали топлотом, протеини су инкубирани у 50% глицеролу у PBS-у током 20 минута на 95 °C.
За in vitro EPP активност, протеин је инкубиран са 3D20E22P (еквивалентно количини пронађеној у 18 парова MAG, пречишћених помоћу HPLC-MS/MS) у 100 µl пуфера (pH 7,5) који садржи 25 mM Tris, 50 mM сирћетне киселине, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA и 1 mM DTT током 3 сата на 27 °C. Реакција је заустављена додавањем 400 µl метанола и хлађена на -20 °C током 1 сата, а затим центрифугирана на 20.000 g током 10 минута на 4 °C. Супернатант је анализиран помоћу HPLC-MS/MS.
ПЦР фрагменти за EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) и EcK2 (556 bp) су амплификовани из цДНК припремљене из лешева комараца обојених полова. ПЦР фрагмент контроле eGFP (495 bp) је амплификован из претходно описаног pCR2.1-eGFP; ПЦР прајмери ​​су наведени у Проширеној табели података 2. ПЦР фрагмент је уметнут између инвертованих Т7 промотора на плазмиду pL4440. Плазмидне конструкције су изоловане из NEB 5-α компетентне E. coli (New England Biolabs) и верификоване секвенцирањем ДНК пре употребе (видети Додатне податке 1 за секвенцу уметања). Прајмери ​​који се упарују са Т7 промотором (Проширена табела података 2) коришћени су за амплификацију уметака из плазмида заснованог на pL4440. Величина ПЦР производа је потврђена електрофорезом на агарозном гелу. dsRNA је транскрибована из ПЦР шаблона коришћењем Megascript Т7 транскрипционог комплета (Thermo Fisher) и пречишћена према упутствима произвођача са претходно описаним модификацијама.
За ињекцију дсРНК, 1.380 нг дсРНК (дсГФП, дсЕцК1, дсЕцК2, дсЕПП) је убризгано у концентрацији од 10 нг нл-1 у грудни кош одраслих мужјака или женки (Нанојект III, Драмонд) у року од 1 дана након еклозије. Нивои смањења гена одређени су у најмање три биолошка понављања екстракцијом РНК, синтезом цДНК и РТ-кПЦР. За ињекцију екдизона, женке старе 4 дана или 6 дана храњене крвљу су убризгане са 0,13, 0,21 или 0,63 µг 20Е или 3Д20Е (Нанојект III, Драмонд) у концентрацијама од 1,3, 2,1, респективно, у зависности од експерименталног дизајна или 6,3 нг нл-1. Убризгајте 100 нл 10% (вол/вол) етанола у води; 100 nl 3D20E22P у 10% етанолу (еквивалентно 75% количине пронађене у пару MAG-ова). Комарци су насумично распоређени у групу за ињекције.
За тестове мрешћења, женке старе 3 дана храњене су људском крвљу по вољи. Уклоните делимично храњене или нехрањене комарце. У зависности од третмана, женке су смештене у одвојене посуде за мрест четири ноћи, најмање 48 сати након оброка са крвљу. Јаја су бројана под стереоскопом (Stemi 508, Zeiss); код парених женки, јаја која су се излегла у ларве сматрана су оплодним.
За тестове парења, женкама је дозвољено најмање 2 дана, у зависности од третмана, да развију отпорност на парење, а мужјаци дивљег типа усклађених по старости су потом уведени у исти кавез. Две ноћи касније, оплођене везикуле женки су дисециране, а геномска ДНК је ослобођена замрзавањем-одмрзавањем и соникацијом у пуферу који садржи 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA и 25 mM NaCl (pH 8,2). Узорци су инкубирани са протеиназом K (0,86 µg µl-1) током 15 минута на 55 °C, а затим 10 минута на 95 °C. Препарати сирове геномске ДНК су разблажени 10 пута и подвргнути qPCR детекцији секвенци Y хромозома; прајмери ​​су наведени у проширеној табели података 2. Одсуство секвенце Y хромозома указује на то да нема парења.
За тестове поновног парења, женке које су биле под присилним парењем су прегледане на присуство чепова за парење како би се потврдио статус парења и остављено им је 2 дана да развију отпорност на парење у одсуству мужјака, као што је претходно описано 36. Мужјаци који су носили трансгену сперму DsRed су затим уведени у кавезе женки. Две ноћи касније, везикуле за оплодњу су дисециране од женки, а геномска ДНК је припремљена као што је горе описано и подвргнута qPCR детекцији DsRed трансгена; прајмери ​​су наведени у Проширеној табели података 2. Одсуство DsRed трансгена указује да није дошло до поновног парења.
3D20E је синтетисан као што је претходно описано 37. Укратко, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) је растворено у 10 ml воде, након чега је додато 30 mg платинастог црнила (у облику праха, Sigma-Aldrich). Благи млаз O2 је континуирано пропуштан у реакциону смешу, која је мешана на собној температури. Након 6 сати, додато је 30 ml метанола да би се зауставила реакција. Смеша је центрифугирана да би се уклониле честице катализатора. Супернатант је испарен до сува у вакууму на собној температури. Осушени реакциони производ је растворен у 10% етанолу и метанолу за ињекције за HPLC-MS/MS анализу. Стопа конверзије (од 20E до 3D20E) била је приближно 97% (Слика 4б), а MS спектар синтетисаног 3D20E је одговарао оном код парених женки (Слика 4ц).
Легенда садржи специфичне детаље о извршеним статистичким тестовима. GraphPad (верзија 9.0) је коришћен за извођење Фишеровог тачног теста, Мантел-Коксовог теста и Студентовог t-теста. Кокран-Мантел-Хензелови тестови су изведени коришћењем прилагођеног R скрипта (доступног на https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Дистрибуција података је тестирана на нормалност коришћењем Шапиро-Вилковог теста са прагом значајности од 0,05. Када подаци нису прошли тест нормалности, извршен је Ман-Витнијев тест. Подаци о преживљавању су анализирани коришћењем Мантел-Коксовог теста. DESeq2 пакет (верзија 1.28.1) је коришћен за извођење анализе диференцијалне експресије на нивоу гена RNA-seq. Хоризонтална трака на графикону представља медијану. Вредност значајности P = 0,05 је коришћена као праг за све тестове.
За више информација о дизајну студије, погледајте апстракт Извештаја о истраживању природе (Nature Research Report) повезан са овим чланком.
Подаци MS протеомике су депоновани у конзорцијум ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) преко PRIDE партнерског репозиторијума (https://www.ebi.ac.uk/pride/) са идентификатором скупа података PXD032157.
Скуп података RNA-seq је депонован у Свеобухватној библиотеци експресије гена (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под серијским записом GSE198665.
Додатни скупови података генерисани и/или анализирани током текуће студије могу се добити од одговарајућих аутора на разуман захтев. Овај чланак пружа изворне податке.
Де Луф, А. Екдистероиди: Занемарени сексуални стероиди инсеката? Мушки: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Редферн, CPF 20-хидроксиекдизон и развој јајника код Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).