Пропионска киселина (ППА), антифунгално средство и уобичајени дијететски адитив, показала се као узрок абнормалног неуроразвоја код мишева праћеног гастроинтестиналном дисфункцијом, што може бити узроковано цревном дисбиозом. Веза између изложености ППА у исхрани и дисбиозе цревне микробиоте је сугерисана, али није директно испитана. Овде смо истражили промене у саставу цревне микробиоте повезане са ППА које могу довести до дисбиозе. Цревни микробиоми мишева храњених нетретираном исхраном (н=9) и исхраном обогаћеном ППА (н=13) секвенцирани су коришћењем метагеномског секвенцирања дугог домета како би се процениле разлике у микробном саставу и бактеријским метаболичким путевима. ППА у исхрани била је повезана са повећањем бројности значајних таксона, укључујући неколико врста Bacteroides, Prevotella и Ruminococcus, чији су чланови претходно били укључени у производњу ППА. Микробиоми мишева изложених ППА такође су имали више путева повезаних са метаболизмом липида и биосинтезом стероидних хормона. Наши резултати указују да ППА може променити цревну микробиоту и њене повезане метаболичке путеве. Ове примећене промене указују на то да конзерванси класификовани као безбедни за конзумацију могу утицати на састав цревне микробиоте и, последично, на људско здравље. Међу њима, P, G или S се бира у зависности од нивоа класификације који се анализира. Да би се минимизирао утицај лажно позитивних класификација, усвојен је минимални праг релативне абулументе од 1e-4 (1/10.000 очитавања). Пре статистичке анализе, релативне абулументе које је пријавио Бракен (fraction_total_reads) трансформисане су коришћењем центриране логаритамске односне (CLR) трансформације (Aitchison, 1982). CLR метод је изабран за трансформацију података јер је непроменљив у односу на скалу и довољан је за неретке скупове података (Gloor et al., 2017). CLR трансформација користи природни логаритам. Подаци о бројању које је пријавио Бракен нормализовани су коришћењем релативног логаритамског израза (RLE) (Anders and Huber, 2010). Слике су генерисане коришћењем комбинације matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 и секвенцијалних логаритама (Gloor et al., 2017). 0.12.2 и стантанотације верзије 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Однос Bacillus/Bacteroidetes израчунат је за сваки узорак коришћењем нормализованих бројева бактерија. Вредности приказане у табелама су заокружене на 4 децимална места. Симпсонов индекс разноликости израчунат је коришћењем скрипте alpha_diversity.py која је доступна у пакету KrakenTools верзије 1.2 (Lu et al., 2022). Извештај о Бракену је дат у скрипти, а Симпсонов индекс „Si“ је дат за параметар -an. Значајне разлике у бројности дефинисане су као средње разлике CLR ≥ 1 или ≤ -1. Средња разлика CLR од ±1 указује на повећање бројности типа узорка за 2,7 пута. Знак (+/-) означава да ли је таксон бројнији у PPA узорку и контролном узорку, респективно. Значајност је одређена коришћењем Ман-Витни U теста (Virtanen et al., 2020). Коришћен је Statsmodels v. 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010), а Бенџамини-Хохбергова процедура је примењена за корекцију вишеструког тестирања. Прилагођена p-вредност ≤ 0,05 је коришћена као праг за одређивање статистичке значајности.
Људски микробиом се често назива „последњим органом тела“ и игра виталну улогу у људском здрављу (Baquero and Nombela, 2012). Посебно је цревни микробиом препознат по свом утицају на цео систем и улози у многим есенцијалним функцијама. Комензалне бактерије су бројне у цревима, заузимајући вишеструке еколошке нише, користећи хранљиве материје и такмичећи се са потенцијалним патогенима (Jandhyala et al., 2015). Разноврсне бактеријске компоненте цревног микробиота способне су да производе есенцијалне хранљиве материје као што су витамини и да подстичу варење (Rowland et al., 2018). Такође је показано да бактеријски метаболити утичу на развој ткива и побољшавају метаболичке и имунолошке путеве (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Састав људског цревног микробиома је изузетно разнолик и зависи од генетских и фактора животне средине као што су исхрана, пол, лекови и здравствено стање (Kumbhare et al., 2019).
Мајчина исхрана је кључна компонента феталног и неонаталног развоја и претпостављени извор једињења која могу утицати на развој (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Једно такво једињење од интереса је пропионска киселина (PPA), нуспроизвод масне киселине кратког ланца добијен бактеријском ферментацијом и адитив за храну (den Besten et al., 2013). PPA има антибактеријска и антифунгална својства и стога се користи као конзерванс за храну и у индустријским применама за инхибицију раста буђи и бактерија (Wemmenhove et al., 2016). PPA има различите ефекте у различитим ткивима. У јетри, PPA има антиинфламаторне ефекте утичући на експресију цитокина у макрофагима (Kawasoe et al., 2022). Овај регулаторни ефекат је такође примећен у другим имуним ћелијама, што доводи до смањења упале (Haase et al., 2021). Међутим, супротан ефекат је примећен у мозгу. Претходне студије су показале да изложеност PPA изазива понашање слично аутизму код мишева (El-Ansary et al., 2012). Друге студије су показале да ППА може изазвати глиозу и активирати проинфламаторне путеве у мозгу (Abdelli et al., 2019). Пошто је ППА слаба киселина, она може дифундовати кроз цревни епител у крвоток и тако прећи рестриктивне баријере, укључујући крвно-мождану баријеру, као и плаценту (Stinson et al., 2019), што истиче важност ППА као регулаторног метаболита који производе бактерије. Иако се потенцијална улога ППА као фактора ризика за аутизам тренутно истражује, њени ефекти на особе са аутизмом могу се проширити изван индуковања неуралне диференцијације.
Гастроинтестинални симптоми попут дијареје и констипације чести су код пацијената са неуроразвојним поремећајима (Cao et al., 2021). Претходне студије су показале да се микробиом пацијената са поремећајима из аутистичног спектра (АСД) разликује од микробиома здравих особа, што указује на присуство дисбиозе цревне микробиоте (Finegald et al., 2010). Слично томе, карактеристике микробиома пацијената са инфламаторним болестима црева, гојазношћу, Алцхајмеровом болешћу итд. такође се разликују од карактеристика здравих особа (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Међутим, до данас није утврђена узрочна веза између цревног микробиома и неуролошких болести или симптома (Yap et al., 2021), иако се сматра да неколико бактеријских врста игра улогу у неким од ових болесних стања. На пример, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio и други родови су заступљенији у микробиоти пацијената са аутизмом (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Приметно је да су врсте чланови неких од ових родова познате по томе што поседују гене повезане са производњом PPA (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). С обзиром на антимикробна својства PPA, повећање њене количине може бити корисно за раст бактерија које производе PPA (Jacobson et al., 2018). Дакле, окружење богато PFA може довести до промена у цревној микробиоти, укључујући гастроинтестиналне патогене, што могу бити потенцијални фактори који доводе до гастроинтестиналних симптома.
Централно питање у истраживању микробиома је да ли су разлике у микробном саставу узрок или симптом основних болести. Први корак ка разјашњавању сложеног односа између исхране, цревног микробиома и неуролошких болести јесте процена ефеката исхране на микробни састав. У ту сврху, користили смо метагеномско секвенцирање дугог читања како бисмо упоредили цревни микробиом потомства мишева храњених исхраном богатом или сиромашном ППА. Потомство је храњено истом исхраном као и њихове мајке. Претпоставили смо да ће исхрана богата ППА довести до промена у цревном микробном саставу и микробним функционалним путевима, посебно онима који су повезани са метаболизмом ППА и/или производњом ППА.
У овој студији коришћени су трансгени мишеви FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) који прекомерно експресују зелени флуоресцентни протеин (GFP) под контролом глија-специфичног GFAP промотера, пратећи смернице Комитета за институционалну негу и коришћење животиња Универзитета Централне Флориде (UCF-IACUC) (број дозволе за употребу животиња: PROTO202000002). Након одбијања, мишеви су смештени појединачно у кавезе са 1–5 мишева сваког пола по кавезу. Мишеви су храњени ad libitum или пречишћеном контролном дијетом (модификована отворена стандардна дијета, 16 kcal% масти) или дијетом са додатком натријум пропионата (модификована отворена стандардна дијета, 16 kcal% масти, која садржи 5.000 ppm натријум пропионата). Количина коришћеног натријум пропионата била је еквивалентна 5.000 мг PFA/кг укупне тежине хране. Ово је највећа концентрација PPA одобрена за употребу као конзерванс за храну. Да би се припремили за ову студију, родитељски мишеви су храњени обема дијетама 4 недеље пре парења и наставили су током целе трудноће мајке. Потомци мишева [22 миша, 9 контролних (6 мужјака, 3 женке) и 13 прасеца (4 мужјака, 9 женки)] су одбијени од сисе, а затим су наставили са истом дијетом као и мајке током 5 месеци. Потомци мишева су жртвовани у доби од 5 месеци, а њихов цревни фецес је сакупљен и првобитно чуван у микроцентрифужним епруветама од 1,5 мл на -20°C, а затим пребачен у замрзивач на -80°C док се ДНК домаћина није исцрпела и микробне нуклеинске киселине нису екстраховане.
ДНК домаћина је уклоњена према модификованом протоколу (Charalampous et al., 2019). Укратко, садржај фекалија је пребачен у 500 µl InhibitEX-а (Qiagen, Cat#/ID: 19593) и чуван замрзнут. Обрадити највише 1-2 фекалне пелете по екстракцији. Садржај фекалија је затим механички хомогенизован коришћењем пластичног тучка унутар епрувете да би се формирала суспензија. Центрифугирати узорке на 10.000 RCF током 5 минута или док се узорци не пелетирају, затим аспирирати супернатант и ресуспендовати пелет у 250 µl 1× PBS. Додати 250 µl 4,4% раствора сапонина (TCI, број производа S0019) узорку као детерџент за олабављање еукариотских ћелијских мембрана. Узорци су пажљиво мешани док не постану глатки и инкубирани на собној температури током 10 минута. Затим, да би се разбиле еукариотске ћелије, узорку је додато 350 μl воде без нуклеазе, инкубирано 30 секунди, а затим је додато 12 μl 5 M NaCl. Узорци су затим центрифугирани на 6000 RCF током 5 минута. Аспирирати супернатант и ресуспендовати талог у 100 μl 1X PBS. Да би се уклонила ДНК домаћина, додати 100 μl HL-SAN пуфера (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml воде без нуклеазе) и 10 μl HL-SAN ензима (ArticZymes P/N 70910-202). Узорци су темељно помешани пипетирањем и инкубирани на 37 °C током 30 минута при 800 обртаја у минути на Eppendorf™ ThermoMixer C. Након инкубације, центрифугирани су на 6000 RCF током 3 минута и испрани два пута са 800 µl и 1000 µl 1X PBS. На крају, талог је ресуспендован у 100 µl 1X PBS.
Укупна бактеријска ДНК је изолована коришћењем комплета за пречишћавање геномске ДНК компаније New England Biolabs Monarch (New England Biolabs, Ipswich, MA, кат. бр. T3010L). Стандардна оперативна процедура која се испоручује уз комплет је мало модификована. Инкубирајте и одржавајте воду без нуклеаза на 60°C пре операције за коначну елуцију. Додајте 10 µl протеиназе К и 3 µl RNase A сваком узорку. Затим додајте 100 µl пуфера за лизу ћелија и лагано промешајте. Узорци су затим инкубирани у Eppendorf™ ThermoMixer C на 56°C и 1400 rpm током најмање 1 сата, а највише 3 сата. Инкубирани узорци су центрифугирани на 12.000 RCF током 3 минута, а супернатант из сваког узорка је пребачен у посебну микроцентрифужну епрувету од 1,5 mL која садржи 400 µL раствора за везивање. Епрувете су затим пулсирајуће мешане 5–10 секунди у интервалима од 1 секунде. Пребаците целокупни течни садржај сваког узорка (приближно 600–700 µL) у филтер кертриџ смештен у проточну епрувету за сакупљање. Епрувете су центрифугиране на 1.000 RCF током 3 минута да би се омогућило почетно везивање ДНК, а затим су центрифугиране на 12.000 RCF током 1 минута да би се уклонила преостала течност. Колона са узорком је пребачена у нову епрувету за сакупљање, а затим испрана два пута. За прво испирање, додајте 500 µL пуфера за испирање у сваку епрувету. Окрените епрувету 3–5 пута, а затим центрифугирајте на 12.000 RCF током 1 минута. Баците течност из епрувете за сакупљање и вратите филтер кертриџ у исту епрувету за сакупљање. За друго испирање, додајте 500 µL пуфера за испирање у филтер без окретања. Узорци су центрифугирани на 12.000 RCF током 1 минута. Пребаците филтер у LoBind® епрувету од 1,5 mL и додајте 100 µL претходно загрејане воде без нуклеаза. Филтери су инкубирани на собној температури током 1 минута, а затим центрифугирани на 12.000 RCF током 1 минута. Елуирана ДНК је чувана на -80°C.
Концентрација ДНК је квантификована коришћењем Qubit™ 4.0 флуорометра. ДНК је припремљена коришћењем Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit-а (кат. бр. Q33231) према упутствима произвођача. Дистрибуција дужине фрагмената ДНК је мерена коришћењем Aglient™ 4150 или 4200 TapeStation-а. ДНК је припремљена коришћењем Agilent™ Genomic DNA Reagents-а (кат. бр. 5067-5366) и Genomic DNA ScreenTape-а (кат. бр. 5067-5365). Припрема библиотеке је извршена коришћењем Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit-а (SQK-RPB004) према упутствима произвођача. ДНК је секвенцирана коришћењем ONT GridION™ Mk1 секвенцера са Min106D проточном ћелијом (R 9.4.1). Подешавања секвенцирања су била: позивање база високе прецизности, минимална q вредност од 9, подешавање бар-кода и скраћивање бар-кода. Узорци су секвенционирани 72 сата, након чега су подаци о базном позиву послати на даљу обраду и анализу.
Биоинформатичка обрада је извршена коришћењем претходно описаних метода (Greenman et al., 2024). FASTQ датотеке добијене секвенцирањем су подељене у директоријуме за сваки узорак. Пре биоинформатичке анализе, подаци су обрађени коришћењем следећег процеса: прво, FASTQ датотеке узорака су спојене у једну FASTQ датотеку. Затим, очитавања краћа од 1000 bp су филтрирана коришћењем Filtlong v. 0.2.1, при чему је једини промењени параметар био –min_length 1000 (Wick, 2024). Пре даљег филтрирања, квалитет очитавања је контролисан коришћењем NanoPlot v. 1.41.3 са следећим параметрима: –fastq –plots dot –N50 -o
За таксономску класификацију, очитавања и састављени контизи су класификовани коришћењем Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Генеришите извештаје и излазне датотеке за очитавања и склопове, респективно. Користите опцију –use-names за анализу очитавања и склопова. Опције –gzip-compressed и –paired су наведене за сегменте очитавања. Релативна бројност таксона у метагеномима процењена је коришћењем Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Прво смо креирали kmer базу података која садржи 1000 база користећи bracken-build са следећим параметрима: -d
Анотација гена и процена релативне количине извршене су коришћењем модификоване верзије протокола који су описали Маранга и др. (Maranga et al., 2023). Прво, контизи краћи од 500 bp су уклоњени из свих склопова коришћењем SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Одабрани склопови су затим комбиновани у пан-метагеном. Отворени оквири за читање (ORF) су идентификовани коришћењем Prodigal v. 1.0.1 (паралелна верзија Prodigal v. 2.6.3) са следећим параметрима: -d
Гени су прво груписани према идентификаторима ортолога (KO) из Кјото енциклопедије гена и генома (KEGG) које је доделио eggNOG ради упоређивања обиља генских путева. Гени без нокаута или гени са вишеструким нокаутима су уклоњени пре анализе. Затим је израчуната просечна обиље сваког KO по узорку и извршена је статистичка анализа. Гени метаболизма PPA су дефинисани као било који ген коме је додељен ред ko00640 у колони KEGG_Pathway, што указује на улогу у метаболизму пропионата према KEGG. Гени идентификовани као повезани са производњом PPA наведени су у Додатној табели 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Тестови пермутације су извршени да би се идентификовали гени метаболизма и производње PPA који су били значајно заступљенији у сваком типу узорка. Хиљаду пермутација је извршено за сваки анализирани ген. p-вредност од 0,05 је коришћена као гранична вредност за одређивање статистичке значајности. Функционалне анотације су додељене појединачним генима унутар кластера на основу анотација репрезентативних гена унутар кластера. Таксони повезани са метаболизмом ППА и/или производњом ППА могли су се идентификовати упаривањем контиг ИД-ова у излазним датотекама Kraken2 са истим контиг ИД-овима задржаним током функционалне анотације коришћењем eggNOG. Тестирање значајности је извршено коришћењем Ман-Витнијевог U теста који је претходно описан. Корекција за вишеструко тестирање је извршена коришћењем Бенџамини-Хохбергове процедуре. p-вредност ≤ 0,05 је коришћена као гранична вредност за одређивање статистичке значајности.
Разноликост цревног микробиома мишева процењена је коришћењем Симпсоновог индекса разноликости. Нису примећене значајне разлике између контролних и PPA узорака у погледу родовске и врсте разноликости (p-вредност за род: 0,18, p-вредност за врсту: 0,16) (Слика 1). Микробни састав је затим упоређен коришћењем анализе главних компоненти (PCA). Слика 2 приказује груписање узорака по њиховим филума, што указује да постоје разлике у врстама микробиома између PPA и контролних узорака. Ово груписање је било мање изражено на нивоу рода, што сугерише да PPA утиче на одређене бактерије (Допунска слика 1).
Слика 1. Алфа разноврсност родова и састав врста микробиома црева миша. Кутијасти дијаграми приказују Симпсонове индексе разноврсности родова (А) и врста (Б) у PPA и контролним узорцима. Значајност је одређена коришћењем Ман-Витнијевог U теста, а вишеструка корекција је извршена коришћењем Бенџамини-Хохбергове процедуре. ns, p-вредност није била значајна (p>0,05).
Слика 2. Резултати анализе главних компоненти састава цревног микробиома миша на нивоу врсте. График анализе главних компоненти приказује расподелу узорака по њиховим прве две главне компоненте. Боје означавају тип узорка: мишеви изложени PPA су љубичасти, а контролни мишеви жути. Главне компоненте 1 и 2 су приказане на x-оси и y-оси, респективно, и изражене су као њихов објашњени однос варијансе.
Користећи RLE трансформисане податке о бројању, примећено је значајно смањење медијанског односа Bacteroidetes/Bacilli код контролних и PPA мишева (контрола: 9,66, PPA: 3,02; p-вредност = 0,0011). Ова разлика је била последица веће количине Bacteroidetes код PPA мишева у поређењу са контролама, иако разлика није била значајна (средња вредност CLR код контроле: 5,51, средња вредност CLR код PPA: 6,62; p-вредност = 0,054), док је количина Bacteroidetes била слична (средња вредност CLR код контроле: 7,76, средња вредност CLR код PPA: 7,60; p-вредност = 0,18).
Анализа бројности таксономских чланова цревног микробиома показала је да се 1 тип и 77 врста значајно разликују између PPA и контролних узорака (Додатна табела 2). Бројност 59 врста у PPA узорцима била је значајно већа него у контролним узорцима, док је бројност само 16 врста у контролним узорцима била већа него у PPA узорцима (Слика 3).
Слика 3. Разлика у бројности таксона у цревном микробиому PPA и контролних мишева. Вулкански дијаграми приказују разлике у бројности родова (А) или врста (Б) између PPA и контролних узорака. Сиве тачке указују на то да нема значајне разлике у бројности таксона. Обојене тачке указују на значајне разлике у бројности (p-вредност ≤ 0,05). Првих 20 таксона са највећим разликама у бројности између типова узорака приказано је црвеном и светло плавом бојом (контролни и PPA узорци), респективно. Жуте и љубичасте тачке биле су најмање 2,7 пута бројније у контролним или PPA узорцима него у контролним. Црне тачке представљају таксоне са значајно различитим бројностима, са средњим разликама CLR између -1 и 1. P вредности су израчунате коришћењем Ман-Витни U теста и кориговане за вишеструко тестирање коришћењем Бенџамини-Хохбергове процедуре. Подебљане средње разлике CLR указују на значајне разлике у бројности.
Након анализе микробног састава црева, извршили смо функционалну анотацију микробиома. Након филтрирања гена ниског квалитета, идентификовано је укупно 378.355 јединствених гена у свим узорцима. Трансформисана количина ових гена коришћена је за анализу главних компоненти (PCA), а резултати су показали висок степен груписања типова узорака на основу њихових функционалних профила (Слика 4).
Слика 4. Резултати PCA коришћењем функционалног профила цревног микробиома миша. PCA графикон приказује дистрибуцију узорака по њиховим прве две главне компоненте. Боје означавају тип узорка: мишеви изложени PPA су љубичасти, а контролни мишеви жути. Главне компоненте 1 и 2 су приказане на x-оси и y-оси, респективно, и изражене су као њихов објашњени однос варијансе.
Затим смо испитали бројност KEGG нокаута у различитим типовима узорака. Укупно је идентификовано 3648 јединствених нокаута, од којих је 196 било значајно заступљеније у контролним узорцима, а 106 у PPA узорцима (Слика 5). Укупно 145 гена је откривено у контролним узорцима и 61 ген у PPA узорцима, са значајно различитим бројем. Путеви повезани са метаболизмом липида и аминошећера били су значајно обогаћенији у PPA узорцима (Додатна табела 3). Путеви повезани са метаболизмом азота и системима релеја сумпора били су значајно обогаћенији у контролним узорцима (Додатна табела 3). Бројност гена повезаних са метаболизмом аминошећера/нуклеотида (ko:K21279) и метаболизмом инозитол фосфата (ko:K07291) била је значајно већа у PPA узорцима (Слика 5). Контролни узорци су имали значајно више гена повезаних са метаболизмом бензоата (ko:K22270), метаболизмом азота (ko:K00368) и гликолизом/глуконеогенезом (ko:K00131) (Слика 5).
Сл. 5. Разлика у обиљу КО у цревном микробиому ППА и контролних мишева. Вулкански дијаграм приказује разлике у обиљу функционалних група (КО). Сиве тачке означавају КО чије обиље није било значајно другачије између типова узорака (p-вредност > 0,05). Обојене тачке означавају значајне разлике у обиљу (p-вредност ≤ 0,05). 20 КО са највећим разликама у обиљу између типова узорака приказано је црвеном и светло плавом бојом, што одговара контролним и ППА узорцима, респективно. Жуте и љубичасте тачке означавају КО које су биле најмање 2,7 пута обилније у контролним и ППА узорцима, респективно. Црне тачке означавају КО са значајно различитим обиљем, са средњим разликама у CLR између -1 и 1. P вредности су израчунате коришћењем Ман-Витни U теста и прилагођене за вишеструка поређења коришћењем Бенџамини-Хохберг поступка. NaN означава да КО не припада путањи у KEGG. Подебљане средње вредности разлике у CLR указују на значајне разлике у обиљу. За детаљне информације о путевима којима припадају наведени КО, погледајте Додатну табелу 3.
Међу означеним генима, 1601 ген је имао значајно различиту заступљеност између типова узорака (p ≤ 0,05), при чему је сваки ген био најмање 2,7 пута заступљенији. Од ових гена, 4 гена су била заступљенија у контролним узорцима, а 1597 гена је било заступљеније у узорцима PPA. Пошто PPA има антимикробна својства, испитали смо заступљеност гена за метаболизам и производњу PPA између типова узорака. Међу 1332 гена повезаних са метаболизмом PPA, 27 гена је било значајно заступљеније у контролним узорцима, а 12 гена је било заступљеније у узорцима PPA. Међу 223 гена повезана са производњом PPA, 1 ген је био значајно заступљенији у узорцима PPA. Слика 6А додатно показује већу заступљеност гена укључених у метаболизам PPA, са значајно већом заступљеношћу у контролним узорцима и великим величинама ефеката, док слика 6Б истиче појединачне гене са значајно већом заступљеношћу примећеном у узорцима PPA.
Сл. 6. Диференцијална заступљеност гена повезаних са PPA у микробиому црева миша. Вулкански дијаграми приказују разлике у заступљености гена повезаних са метаболизмом PPA (А) и производњом PPA (Б). Сиве тачке означавају гене чија заступљеност се није значајно разликовала између типова узорака (p-вредност > 0,05). Обојене тачке означавају значајне разлике у заступљености (p-вредност ≤ 0,05). 20 гена са највећим разликама у заступљености приказано је црвеном и светло плавом бојом (контролни и PPA узорци), респективно. Заступљеност жутих и љубичастих тачака била је најмање 2,7 пута већа у контролним и PPA узорцима него у контролним узорцима. Црне тачке представљају гене са значајно различитим заступљеностима, са средњим разликама CLR између -1 и 1. P вредности су израчунате коришћењем Ман-Витни U теста и кориговане за вишеструка поређења коришћењем Бенџамини-Хохберг поступка. Гени одговарају репрезентативним генима у нередундантном каталогу гена. Имена гена се састоје од KEGG симбола који означава KO ген. Подебљане средње разлике CLR означавају значајно различиту заступљеност. Цртица (-) означава да не постоји симбол за ген у KEGG бази података.
Таксони са генима повезаним са метаболизмом и/или производњом ППА идентификовани су упаривањем таксономског идентитета контига са ИД-ом контига гена. На нивоу рода, утврђено је да 130 родова има гене повезане са метаболизмом ППА, а 61 род има гене повезане са производњом ППА (Додатна табела 4). Међутим, ниједан род није показао значајне разлике у бројности (p > 0,05).
На нивоу врста, утврђено је да 144 бактеријске врсте имају гене повезане са метаболизмом ППА, а 68 бактеријских врста има гене повезане са производњом ППА (Додатна табела 5). Међу метаболизаторима ППА, осам бактерија је показало значајно повећање бројности између типова узорака, и све су показале значајне промене у ефекту (Додатна табела 6). Сви идентификовани метаболизатори ППА са значајним разликама у бројности били су бројнији у узорцима ППА. Класификација на нивоу врста открила је представнике родова који се нису значајно разликовали између типова узорака, укључујући неколико врста Bacteroides и Ruminococcus, као и Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus и Alcaligenes polymorpha. Међу бактеријама које производе ППА, четири бактерије су показале значајне разлике у бројности између типова узорака. Врсте са значајним разликама у бројности укључивале су Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis и Ruminococcus bovis.
У овој студији, испитали смо ефекте изложености ППА на цревну микробиоту мишева. ППА може изазвати различите реакције код бактерија јер је производе одређене врсте, користе је као извор хране друге врсте или има антимикробне ефекте. Стога, њено додавање у цревну средину путем дијететских суплемената може имати различите ефекте у зависности од толеранције, осетљивости и способности да се користи као извор хранљивих материја. Осетљиве бактеријске врсте могу бити елиминисане и замењене онима које су отпорније на ППА или које су способне да је користе као извор хране, што доводи до промена у саставу цревне микробиоте. Наши резултати су открили значајне разлике у микробном саставу, али не и утицај на укупну микробну разноликост. Највећи ефекти су примећени на нивоу врста, са преко 70 таксона који се значајно разликују у бројности између ППА и контролних узорака (Додатна табела 2). Даља евалуација састава узорака изложених ППА открила је већу хетерогеност микробних врста у поређењу са неизложеним узорцима, што сугерише да ППА може побољшати карактеристике раста бактерија и ограничити бактеријске популације које могу преживети у срединама богатим ППА. Дакле, ППА може селективно изазвати промене, а не изазвати широко распрострањено поремећаје разноликости цревне микробиоте.
Претходно је показано да конзерванси за храну, као што је PPA, мењају количину компоненти цревног микробиома без утицаја на укупну разноликост (Nagpal et al., 2021). Овде смо уочили најупечатљивије разлике између врста Bacteroidetes унутар типа Bacteroidetes (раније познатих као Bacteroidetes), које су биле значајно обогаћене код мишева изложених PPA. Повећана количина врста Bacteroides повезана је са повећаном разградњом слузи, што може повећати ризик од инфекције и подстаћи упалу (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Једна студија је открила да су новорођени мужјаци мишева третирани са Bacteroides fragilis показивали социјално понашање које подсећа на поремећај из аутистичног спектра (ASD) (Carmel et al., 2023), а друге студије су показале да врсте Bacteroides могу променити имунолошку активност и довести до аутоимуне инфламаторне кардиомиопатије (Gil-Cruz et al., 2019). Врсте које припадају родовима Ruminococcus, Prevotella и Parabacteroides такође су биле значајно повећане код мишева изложених PPA (Coretti et al., 2018). Одређене врсте Ruminococcus повезане су са болестима попут Кронове болести кроз производњу проинфламаторних цитокина (Henke et al., 2019), док су врсте Prevotella, попут Prevotella humani, повезане са метаболичким болестима попут хипертензије и осетљивости на инсулин (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Коначно, открили смо да је однос Bacteroidetes (раније познатих као Firmicutes) и Bacteroidetes био значајно нижи код мишева изложених PPA него код контролних мишева због већег укупног броја врста Bacteroidetes. Претходно се показало да је овај однос важан индикатор цревне хомеостазе, а поремећаји у овом односу повезани су са различитим болесним стањима (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), укључујући инфламаторне болести црева (Stojanov et al., 2020). Заједно, врсте из типа Bacteroidetes изгледа да су највише погођене повишеним уносом ППА у исхрани. То може бити због веће толеранције на ППА или способности коришћења ППА као извора енергије, што се показало тачним за најмање једну врсту, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Алтернативно, изложеност мајке ППА може побољшати развој фетуса чинећи црева потомства миша подложнијим колонизацији Bacteroidetes; међутим, наш дизајн студије није дозволио такву процену.
Метагеномска процена садржаја открила је значајне разлике у обиљу гена повезаних са метаболизмом и производњом ППА, при чему су мишеви изложени ППА показали веће обиље гена одговорних за производњу ППА, док су мишеви који нису били изложени ППА показали веће обиље гена одговорних за метаболизам ПАА (Слика 6). Ови резултати сугеришу да ефекат ППА на микробни састав можда није искључиво последица његове употребе, у супротном би обиље гена повезаних са метаболизмом ППА требало да покаже веће обиље у цревном микробиому мишева изложених ППА. Једно објашњење је да ППА посредује у обиљу бактерија првенствено кроз своје антимикробне ефекте, а не кроз његову употребу од стране бактерија као хранљиве материје. Претходне студије су показале да ППА инхибира раст Salmonella Typhimurium на начин зависан од дозе (Jacobson et al., 2018). Излагање вишим концентрацијама ППА може селектовати бактерије које су отпорне на његова антимикробна својства и не морају нужно бити у стању да га метаболишу или производе. На пример, неколико врста Parabacteroides показало је значајно већу заступљеност у узорцима PPA, али нису откривени гени повезани са метаболизмом или производњом PPA (додатне табеле 2, 4 и 5). Штавише, производња PPA као нуспроизвода ферментације је широко распрострањена међу различитим бактеријама (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Већа бактеријска разноликост може бити разлог за већу заступљеност гена повезаних са метаболизмом PPA у контролним узорцима (Averina et al., 2020). Штавише, предвиђено је да су само 27 (2,14%) од 1332 гена гени повезани искључиво са метаболизмом PPA. Многи гени повезани са метаболизмом PPA су такође укључени у друге метаболичке путеве. Ово додатно показује да је заступљеност гена укључених у метаболизам PPA била већа у контролним узорцима; ови гени могу функционисати у путевима који не резултирају искоришћавањем или формирањем PPA као нуспроизвода. У овом случају, само један ген повезан са стварањем PPA показао је значајне разлике у заступљености између типова узорака. За разлику од гена повезаних са метаболизмом ППА, маркер гени за производњу ППА су одабрани зато што су директно укључени у бактеријски пут за производњу ППА. Код мишева изложених ППА, утврђено је да све врсте имају значајно повећану количину и капацитет за производњу ППА. Ово подржава предвиђање да ће ППА одабрати произвођаче ППА и стога предвиђати да ће се капацитет производње ППА повећати. Међутим, количина гена не мора нужно бити у корелацији са експресијом гена; стога, иако је количина гена повезаних са метаболизмом ППА већа у контролним узорцима, стопа експресије може бити другачија (Shi et al., 2014). Да би се потврдила веза између преваленције гена који производе ППА и производње ППА, потребне су студије експресије гена укључених у производњу ППА.
Функционална анотација метагенома PPA и контролних метагенома открила је неке разлике. PCA анализа садржаја гена открила је дискретне кластере између узорака PPA и контролних узорака (Слика 5). Груписање унутар узорка показало је да је садржај контролних гена био разноврснији, док су се узорци PPA груписали заједно. Груписање по садржају гена било је упоредиво са груписањем по саставу врста. Дакле, разлике у обиљу путева су у складу са променама у обиљу специфичних врста и сојева унутар њих. У узорцима PPA, два пута са значајно већим обиљем била су повезана са метаболизмом аминошећера/нуклеотидног шећера (ko:K21279) и вишеструким путевима метаболизма липида (ko:K00647, ko:K03801; Додатна табела 3). Познато је да су гени повезани са ko:K21279 повезани са родом Bacteroides, једним од родова са значајно већим бројем врста у узорцима PPA. Овај ензим може да избегне имуни одговор експресијом капсуларних полисахарида (Wang et al., 2008). Ово може објаснити повећање Bacteroidetes примећено код мишева изложених PPA. Ово допуњује повећану синтезу масних киселина примећену у микробиому PPA. Бактерије користе пут FASIIko:K00647 (fabB) за производњу масних киселина, што може утицати на метаболичке путеве домаћина (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), а промене у метаболизму липида могу играти улогу у неуроразвоју (Yu et al., 2020). Још један пут који показује повећану количину у узорцима PPA била је биосинтеза стероидних хормона (ko:K12343). Све је више доказа да постоји инверзна веза између способности цревне микробиоте да утиче на нивое хормона и да буде под утицајем хормона, тако да повишени нивои стероида могу имати последице по здравље (Tetel et al., 2018).
Ова студија није без ограничења и разматрања. Важна разлика је у томе што нисмо вршили физиолошке процене животиња. Стога није могуће директно закључити да ли су промене у микробиому повезане са неком болешћу. Још једно разматрање је да су мишеви у овој студији храњени истом исхраном као и њихове мајке. Будуће студије могу утврдити да ли прелазак са исхране богате ППА на исхрану без ППА побољшава њене ефекте на микробиом. Једно ограничење наше студије, као и многих других, је ограничена величина узорка. Иако се могу извући валидни закључци, већа величина узорка би пружила већу статистичку снагу при анализи резултата. Такође смо опрезни у вези са извођењем закључака о повезаности између промена у цревном микробиому и било које болести (Yap et al., 2021). Збуњујући фактори, укључујући старост, пол и исхрану, могу значајно утицати на састав микроорганизама. Ови фактори могу објаснити недоследности примећене у литератури у вези са повезаношћу цревног микробиома са сложеним болестима (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). На пример, показало се да су чланови рода Bacteroidetes или повећани или смањени код животиња и људи са аутизмом (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Слично томе, студије састава црева код пацијената са инфламаторним болестима црева пронашле су и повећање и смањење код истих таксона (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Да бисмо ограничили утицај родне пристрасности, покушали смо да обезбедимо једнаку заступљеност полова тако да су разлике највероватније биле вођене исхраном. Један од изазова функционалне анотације је уклањање сувишних генских секвенци. Наша метода груписања гена захтева 95% идентитета секвенци и 85% сличности дужине, као и 90% покривености поравнања како би се елиминисало лажно груписање. Међутим, у неким случајевима, приметили смо COG са истим анотацијама (нпр. MUT) (Сл. 6). Потребна су даља истраживања како би се утврдило да ли су ови ортолози различити, повезани са специфичним родовима или је ово ограничење приступа груписања гена. Још једно ограничење функционалне анотације је потенцијална погрешна класификација; бактеријски ген mmdA је познати ензим укључен у синтезу пропионата, али KEGG га не повезује са метаболичким путем пропионата. Насупрот томе, ортолози scpB и mmcD су повезани. Велики број гена без означених нокаута може довести до немогућности идентификације гена повезаних са PPA приликом процене бројности гена. Будуће студије ће имати користи од анализе метатранскриптома, која може пружити дубље разумевање функционалних карактеристика цревне микробиоте и повезати експресију гена са потенцијалним низводним ефектима. За студије које укључују специфичне неуроразвојне поремећаје или инфламаторне болести црева, потребне су физиолошке и бихевиоралне процене животиња како би се повезале промене у саставу микробиома са овим поремећајима. Додатне студије трансплантације цревног микробиома у мишеве без клица такође би биле корисне да би се утврдило да ли је микробиом покретач или карактеристика болести.
Укратко, показали смо да ППА из исхране делује као фактор у промени састава цревне микробиоте. ППА је конзерванс одобрен од стране ФДА, који се широко налази у разним намирницама и који, након дуготрајног излагања, може довести до поремећаја нормалне цревне флоре. Пронашли смо промене у бројности неколико бактерија, што сугерише да ППА може утицати на састав цревне микробиоте. Промене у микробиоти могу довести до промена у нивоима одређених метаболичких путева, што може довести до физиолошких промена које су релевантне за здравље домаћина. Потребна су даља истраживања како би се утврдило да ли ефекти ППА из исхране на микробни састав могу довести до дисбиозе или других болести. Ова студија поставља темеље за будуће студије о томе како ефекти ППА на састав црева могу утицати на људско здравље.
Скупови података представљени у овој студији доступни су у онлајн репозиторијумима. Назив репозиторијума и приступни број су: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Ову студију на животињама одобрио је Комитет за институционалну негу и коришћење животиња Универзитета Централне Флориде (UCF-IACUC) (број дозволе за коришћење животиња: PROTO202000002). Ова студија је у складу са локалним законима, прописима и институционалним захтевима.
НГ: Концептуализација, Курирање података, Формална анализа, Истраживање, Методологија, Софтвер, Визуелизација, Писање (оригинални нацрт), Писање (преглед и уређивање). ЛА: Концептуализација, Курирање података, Методологија, Ресурси, Писање (преглед и уређивање). СХ: Формална анализа, Софтвер, Писање (преглед и уређивање). СА: Истраживање, Писање (преглед и уређивање). Главни судија: Истраживање, Писање (преглед и уређивање). СН: Концептуализација, Администрација пројекта, Ресурси, Надзор, Писање (преглед и уређивање). ТА: Концептуализација, Администрација пројекта, Надзор, Писање (преглед и уређивање).
Аутори изјављују да нису примили никакву финансијску подршку за истраживање, ауторство и/или објављивање овог чланка.
Аутори изјављују да је истраживање спроведено у одсуству било каквих комерцијалних или финансијских односа који би се могли протумачити као потенцијални сукоб интереса. није применљиво.
Сва мишљења изражена у овом чланку су искључиво мишљења аутора и не одражавају нужно ставове њихових институција, издавача, уредника или рецензената. Издавач не гарантује нити подржава било који производ оцењен у овом чланку, или било какве тврдње њихових произвођача.
Додатни материјал за овај чланак можете пронаћи на мрежи: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Абдели ЛС, Самсам А, Насер СА (2019). Пропионска киселина индукује глиозу и неуроинфламацију регулисањем ПТЕН/АКТ пута код поремећаја из аутистичног спектра. Научни извештаји 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Аичисон, Ј. (1982). Статистичка анализа података о саставу. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ан Ј, Квон Х, Ким ЈЈ (2023). Однос Фирмикути/Бактероидети као фактор ризика за рак дојке. Часопис за клиничку медицину, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Андерс С., Хубер В. (2010). Анализа диференцијалне експресије података о броју секвенци. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Анђелис, МД, Пиколо, М., Ванини, Л., Сирагуса, С., Ђакомо, А.Д., Серазанети, Д.И. и др. (2013). Фекална микробиота и метаболом код деце са аутизмом и первазивним развојним поремећајем који није другачије наведен. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Аверина ОВ, Ковтун АС, Пољакова СИ, Савилова АМ, Ребриков ДВ, Даниленко ВН (2020). Бактеријске неурометаболичке карактеристике цревне микробиоте код мале деце са поремећајима из аутистичног спектра. Часопис за медицинску микробиологију 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Бакеро Ф., Номбела К. (2012). Микробиом као људски орган. Клиничка микробиологија и инфекција 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Баур Т., Дире П. (2023). Нови увиди у физиологију бактерија које производе пропионску киселину: Anaerotignum propionicum и Anaerotignum neopropionicum (раније Clostridium propionicum и Clostridium neopropionicum). Микроорганизми 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Базер ФВ, Спенцер ТЕ, Ву Г, Цудд ТА, Меинингер СЈ (2004). Исхрана мајке и развој фетуса. Ј Нутр. 134, 2169–2172. дои: 10.1093/јн/134.9.2169
Бенџамини, Ј. и Хохберг, Ј. (1995). Контрола стопе лажно позитивних резултата: Практичан и ефикасан приступ вишеструком тестирању. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Време објаве: 18. април 2025.