Имуномодулаторни метаболити су кључна карактеристика туморског микроокружења (ТМЕ), али уз неколико изузетака, њихов идентитет остаје углавном непознат. Овде смо анализирали туморе и Т ћелије из тумора и асцитеса пацијената са високоградним серозним карциномом (ХГСК) како бисмо открили метаболом ових различитих ТМЕ одељака. Асцитес и туморске ћелије имају значајне разлике у метаболитима. У поређењу са асцитесом, Т ћелије које инфилтрирају тумор су значајно обогаћене 1-метилникотинамидом (МНА). Иако је ниво МНА у Т ћелијама повишен, експресија никотинамид Н-метилтрансферазе (ензима који катализује пренос метил група са С-аденозилметионина на никотинамид) је ограничена на фибробласте и туморске ћелије. Функционално, МНА индукује Т ћелије да луче цитокин тумор-некротизни фактор алфа. Стога, МНА изведен из ТМЕ доприноси имунолошкој регулацији Т ћелија и представља потенцијалну мету имунотерапије за лечење рака код људи.
Метаболити изведени из тумора могу имати дубок инхибиторни ефекат на антитуморски имунитет, а све више доказа показује да они такође могу служити као кључна покретачка снага за прогресију болести (1). Поред Варбурговог ефекта, недавно је почео рад на карактеризацији метаболичког стања туморских ћелија и његовог односа са имунолошким стањем туморског микроокружења (ТМЕ). Студије на мишјим моделима и људским Т ћелијама показале су да метаболизам глутамина (2), оксидативни метаболизам (3) и метаболизам глукозе (4) могу деловати независно на различите подгрупе имунских ћелија. Неколико метаболита у овим путевима инхибира антитуморску функцију Т ћелија. Доказано је да блокада коензима тетрахидробиоптерина (BH4) може оштетити пролиферацију Т ћелија, а повећање BH4 у телу може појачати антитуморски имуни одговор посредован CD4 и CD8. Поред тога, имуносупресивни ефекат кинуренина може се поправити применом BH4 (5). Код глиобластома мутанта изоцитрат дехидрогеназе (IDH), секреција енантиометаболичког (R)-2-хидроксиглутарата (R-2-HG) инхибира активацију, пролиферацију и цитолизу Т ћелија (6). Недавно је показано да метилглиоксал, нуспроизвод гликолизе, производе супресорске ћелије мијелоидног порекла, а пренос метилглиоксала преко Т ћелија може инхибирати функцију ефекторских Т ћелија. У лечењу, неутрализација метилглиоксала може превазићи активност супресорских ћелија изведених из мијелоидног порекла (MDSC) и синергистички побољшати терапију блокаде контролних тачака код мишјих модела (7). Ове студије заједно наглашавају кључну улогу метаболита изведених из TME у регулисању функције и активности Т ћелија.
Дисфункција Т ћелија је широко пријављена код рака јајника (8). Ово је делимично последица метаболичких карактеристика својствених хипоксији и абнормалној васкулатури тумора (9), што доводи до конверзије глукозе и триптофана у нуспроизводе као што су млечна киселина и кинуренин. Прекомерни екстрацелуларни лактат смањује производњу интерферона-γ (IFN-γ) и покреће диференцијацију мијелосупресивних подгрупа (10, 11). Конзумирање триптофана директно инхибира пролиферацију Т ћелија и инхибира сигнализацију Т ћелијских рецептора (12-14). Упркос овим запажањима, велики део рада везаног за имуни метаболизам је спроведен у in vitro култури Т ћелија коришћењем оптимизованих медијума или ограничен на хомологне моделе мишева in vivo, од којих ниједно не одражава у потпуности хетерогеност људских карцинома и физиолошког макро и микро окружења.
Заједничка карактеристика рака јајника је перитонеално ширење и појава асцитеса. Акумулација ћелијске течности у асцитесу повезана је са узнапредовалом болешћу и лошом прогнозом (15). Према извештајима, овај јединствени одељак је хипоксичан, има високе нивое васкуларног ендотелног фактора раста (VEGF) и индоламин 2,3-диоксигеназе (IDO), и инфилтриран је Т регулаторним ћелијама и мијелоидним инхибиторним ћелијама (15-18). Метаболичко окружење асцитеса може се разликовати од оног у самом тумору, тако да репрограмирање Т ћелија у перитонеалном простору није јасно. Поред тога, кључне разлике и хетерогеност између асцитеса и метаболита присутних у туморском окружењу могу ометати инфилтрацију имуних ћелија и њихову функцију на туморима, те су потребна даља истраживања.
Да бисмо решили ове проблеме, осмислили смо методу осетљиве сепарације ћелија и течне хроматографије са тандемском масеном спектрометријом (LC-MS/MS) за проучавање различитих типова ћелија (укључујући CD4+ и CD8+ Т ћелије), као и унутар и између тумора. Његови метаболити обухватају ћелије у истом асцитесу и туморском окружењу пацијента. Користимо ову методу у комбинацији са високодимензионалном проточном цитометријом и секвенцирањем РНК појединачних ћелија (scRNA-seq) како бисмо пружили високо резолуциони портрет метаболичког статуса ових кључних популација. Ова метода је открила значајно повећање нивоа 1-метилникотинамида (MNA) у туморским Т ћелијама, а in vitro експерименти су показали да имуномодулаторни ефекат MNA на функцију Т ћелија раније није био познат. Генерално, ова метода открива међусобне метаболичке интеракције између тумора и имуних ћелија и пружа јединствен увид у метаболите имунорегулације, што може бити корисно за лечење имунотерапије рака јајника засноване на Т ћелијама. Могућности лечења.
Користили смо високодимензионалну проточну цитометрију да бисмо истовремено квантификовали унос глукозе [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-деоксиглукоза (2-NBDG) и митохондријалну активност [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) су типични маркери који разликују имуне ћелије и популације туморских ћелија (Табела S2 и Слика S1A). Ова анализа је показала да, у поређењу са Т ћелијама, асцитес и туморске ћелије имају веће нивое уноса глукозе, али имају мање разлике у митохондријалној активности. Просечан унос глукозе туморским ћелијама [CD45-EpCAM (EpCAM)+] је три до четири пута већи од Т ћелија, а просечан унос глукозе CD4+ Т ћелија је 1,2 пута већи од CD8+ Т ћелија, што указује да тумор-инфилтрирајући лимфоцити (TIL) имају различите метаболичке потребе чак и у истом TME (Слика 1A). Насупрот томе, митохондријална активност у туморским ћелијама је слична оној код CD4+ Т ћелија, а митохондријална активност оба типа ћелија је већа од активности CD8+ Т ћелија (Слика 1Б). Генерално, ови резултати откривају метаболички ниво. Метаболичка активност туморских ћелија је већа од активности CD4+ Т ћелија, а метаболичка активност CD4+ Т ћелија је већа од активности CD8+ Т ћелија. Упркос овим ефектима међу типовима ћелија, не постоји конзистентна разлика у метаболичком статусу CD4+ и CD8+ Т ћелија или њиховим релативним пропорцијама у асцитесу у поређењу са туморима (Слика 1Ц). Насупрот томе, у фракцији CD45-ћелија, удео EpCAM+ ћелија у тумору се повећао у поређењу са асцитесом (Слика 1Д). Такође смо приметили јасну метаболичку разлику између EpCAM+ и EpCAM- ћелијских компоненти. EpCAM+ (туморске) ћелије имају већи унос глукозе и митохондријалну активност од EpCAM- ћелија, што је много веће од метаболичке активности фибробласта у туморским ћелијама код TME (Слика 1, Е и Ф).
(А и Б) Медијални интензитет флуоресценције (MFI) апсорпције глукозе (2-NBDG) (А) и митохондријална активност CD4 + Т ћелија (тамноцрвена MitoTracker) (Б) Репрезентативни графикони (лево) и табеларни подаци (десно), CD8 + Т ћелије и EpCAM + CD45-туморске ћелије из асцитеса и тумора. (Ц) Однос CD4 + и CD8 + ћелија (CD3 + Т ћелија) у асцитесу и тумору. (Д) Удео EpCAM + туморских ћелија у асцитесу и тумору (CD45−). (Е и Ф) Апсорпција глукозе EpCAM + CD45-тумор и EpCAM-CD45-матрикс (2-NBDG) (Е) и митохондријална активност (тамноцрвена MitoTracker) (Ф) репрезентативни графикони (лево) и табеларни подаци (десно) Асцитес и туморске ћелије. (Г) Репрезентативни графикони експресије CD25, CD137 и PD1 проточном цитометријом. (H и I) Експресија CD25, CD137 и PD1 на CD4 + T ћелијама (H) и CD8 + T ћелијама (I). (J и K) Наивни, централно меморијски (Tcm), ефекторски (Teff) и ефекторски меморијски (Tem) фенотипови засновани на експресији CCR7 и CD45RO. Репрезентативне слике (лево) и табеларни подаци (десно) CD4 + T ћелија (J) и CD8 + T ћелија (K) у асцитесу и туморима. P вредности одређене упареним t-тестом (*P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001). Линија представља упарене пацијенте (n = 6). FMO, флуоресценција минус један; MFI, средњи интензитет флуоресценције.
Даља анализа је открила друге значајне разлике између високо разрешеног фенотипског статуса Т ћелија. Активиране (Слика 1, G до I) и ефекторске меморијске (Слика 1, J и K) ћелије у туморима су много чешће него асцитес (удео CD3+ Т ћелија). Слично томе, анализа фенотипа експресијом маркера активације (CD25 и CD137) и маркера деплеције [протеин програмиране ћелијске смрти 1 (PD1)] показала је да, иако су метаболичке карактеристике ових популација различите (Слика S1, B до E), нису доследно примећене значајне метаболичке разлике између наивних, ефекторских или меморијских подскупова (Слика S1, F до I). Ови резултати су потврђени коришћењем метода машинског учења за аутоматско додељивање ћелијских фенотипова (21), што је додатно открило присуство великог броја ћелија коштане сржи (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) у асцитесу пацијента (Слика S2A). Међу свим идентификованим типовима ћелија, ова популација мијелоидних ћелија показала је највећу апсорпцију глукозе и митохондријалну активност (Слика S2, B до G). Ови резултати истичу јаке метаболичке разлике између вишеструких типова ћелија које се налазе у асцитесу и туморима код пацијената са ХГСЦ.
Главни изазов у ​​разумевању метабономских карактеристика TIL-а је потреба за изоловањем узорака Т ћелија довољне чистоће, квалитета и количине из тумора. Недавне студије су показале да методе сортирања и обогаћивања перлицама засноване на проточној цитометрији могу довести до промена у ћелијским профилима метаболита (22-24). Да бисмо превазишли овај проблем, оптимизовали смо метод обогаћивања перлицама како бисмо изоловали и изоловали TIL из хируршки ресетованог људског рака јајника пре анализе помоћу LC-MS/MS (видети Материјали и методе; Слика 2А). Да бисмо проценили укупни утицај овог протокола на промене метаболита, упоредили смо профиле метаболита Т ћелија активираних од стране здравих донора након горе наведеног корака одвајања перлица са ћелијама које нису одвојене перлицама, већ су остале на леду. Ова анализа контроле квалитета је показала да постоји висока корелација између ова два услова (r = 0,77), а техничка поновљивост групе од 86 метаболита има високу поновљивост (Слика 2Б). Стога, ове методе могу да изврше прецизну анализу метаболита у ћелијама које пролазе кроз обогаћивање ћелијског типа, пружајући тако прву платформу високе резолуције за идентификацију специфичних метаболита у HGSC, омогућавајући људима да стекну дубље разумевање специфичности ћелија у програму сексуалног метаболизма.
(А) Шематски дијаграм обогаћивања магнетним куглицама. Пре анализе помоћу LC-MS/MS, ћелије ће проћи кроз три узастопна круга обогаћивања магнетним куглицама или ће остати на леду. (Б) Утицај типа обогаћивања на количину метаболита. Просек три мерења за сваки тип обогаћивања ± SE. Сива линија представља однос 1:1. Интра-класна корелација (ICC) поновљених мерења приказана је на ознаци осе. NAD, никотинамид аденин динуклеотид. (Ц) Шематски дијаграм тока рада анализе метаболита пацијента. Асцитес или тумори се сакупљају од пацијената и криопрезервирају. Мали део сваког узорка је анализиран проточном цитометријом, док су преостали узорци прошли кроз три круга обогаћивања за CD4+, CD8+ и CD45- ћелије. Ове ћелијске фракције су анализиране помоћу LC-MS/MS. (Д) Топлотна мапа стандардизоване количине метаболита. Дендрограм представља Вордово груписање еуклидских растојања између узорака. (Е) Анализа главних компоненти (PCA) мапе метаболита узорка, која приказује три понављања сваког узорка, узорци истог пацијента су повезани линијом. (Ф) PCA профила метаболита узорка условљеног пацијентом (тј. коришћењем делимичне редундантности); тип узорка је ограничен конвексним омотачем. PC1, главна компонента 1; PC2, главна компонента 2.
Затим смо применили ову методу обогаћивања да бисмо анализирали 99 метаболита у фракцијама CD4+, CD8+ и CD45-ћелија у примарном асцитесу и туморима шест пацијената са HGSC (слика 2C, слика S3A и табела S3 и S4). Популација од интереса чини 2% до 70% оригиналног великог узорка живих ћелија, а удео ћелија значајно варира између пацијената. Након одвајања перли, обогаћена фракција од интереса (CD4+, CD8+ или CD45-) чини више од 85% свих живих ћелија у узорку у просеку. Ова метода обогаћивања нам омогућава да анализирамо популације ћелија из метаболизма ткива људског тумора, што је немогуће урадити из великих узорака. Користећи овај протокол, утврдили смо да су l-кинуренин и аденозин, ова два добро окарактерисана имуносупресивна метаболита, повишени у туморским Т ћелијама или туморским ћелијама (слика S3, B и C). Стога, ови резултати показују верност и способност наше технологије сепарације ћелија и масене спектрометрије да пронађе биолошки важне метаболите у ткивима пацијената.
Наша анализа је такође открила снажну метаболичку раздвојеност типова ћелија унутар и између пацијената (Слика 2Д и Слика С4А). Посебно, у поређењу са другим пацијентима, пацијент 70 је показао различите метаболичке карактеристике (Слика 2Е и Слика С4Б), што указује на то да може постојати значајна метаболичка хетерогеност између пацијената. Вреди напоменути да је, у поређењу са другим пацијентима (1,2 до 2 литра; Табела С1), укупна количина асцитеса сакупљеног код пацијента 70 (80 мл) била мања. Контрола хетерогености између пацијената током анализе главних компоненти (на пример, коришћењем анализе делимичне редундантности) показује конзистентне промене између типова ћелија, а типови ћелија и/или микроокружење су јасно агрегирани према профилу метаболита (Слика 2Ф). Анализа појединачних метаболита нагласила је ове ефекте и открила значајне разлике између типова ћелија и микроокружења. Вреди напоменути да је најекстремнија примећена разлика MNA, која је обично обогаћена CD45- ћелијама и CD4+ и CD8+ ћелијама које инфилтрирају тумор (Слика 3А). Код CD4+ ћелија, овај ефекат је најочигледнији, а чини се да је и MNA у CD8+ ћелијама снажно погођена околином. Међутим, ово није важно, јер се само код три од шест пацијената може проценити CD8+ скорови тумора. Поред MNA, у различитим типовима ћелија у асцитесу и туморима, други метаболити који су слабо окарактерисани у TIL-у су такође различито богати (слике S3 и S4). Стога, ови подаци откривају обећавајући скуп имуномодулаторних метаболита за даља истраживања.
(А) Нормализовани садржај MNA у CD4+, CD8+ и CD45- ћелијама из асцитеса и тумора. Кутијасти дијаграм приказује медијану (линија), интерквартилни распон (зглоб оквира) и распон података, до 1,5 пута већи од интерквартилног распона (брб оквира). Као што је описано у Материјалима и методама за пацијенте, користите вредност лиме пацијента да бисте одредили P вредност (*P<0,05 и **P<0,01). (Б) Шематски дијаграм метаболизма MNA (60). Метаболити: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-хомоцистеин; NA, никотинамид; MNA, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибоза; NMN, никотинамид мононуклеотид. Ензими (зелено): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуини; NAMPT, никотинамид фосфорибозилтрансфераза; AOX1, алдехид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибозид киназа; NMNAT, никотинамид мононуклеотид аденилат трансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилаза. (C) t-SNE scRNA-seq асцитеса (сива) и тумора (црвена; n = 3 пацијента). (D) Експресија NNMT у различитим ћелијским популацијама идентификованим помоћу scRNA-seq. (E) Експресија NNMT и AOX1 у SK-OV-3, ћелијама људског ембрионалног бубрега (HEK) 293T, Т ћелијама и MNA-третираним Т ћелијама. Пресавијена експресија је приказана у односу на SK-OV-3. Приказан је образац експресије са SEM (n = 6 здравих донора). Ct вредности веће од 35 сматрају се недетектабилним (UD). (Ф) Експресија SLC22A1 и SLC22A2 у SK-OV-3, HEK293T, Т ћелијама и Т ћелијама третираним са 8mM MNA. Приказана је пресавијена експресија у односу на SK-OV-3. Приказан је образац експресије помоћу SEM (n = 6 здравих донора). Вредности Ct веће од 35 сматрају се недетектованим (UD). (Г) Садржај ћелијског MNA у активираним здравим донорским Т ћелијама након 72 сата инкубације са MNA. Приказан је образац експресије помоћу SEM (n = 4 здрава донора).
МНА се производи преносом метил групе са С-аденозил-1-метионина (САМ) на никотинамид (НА) помоћу никотинамид Н-метилтрансферазе (ННМТ; Слика 3Б). ННМТ је прекомерно експресован у различитим људским карциномима и повезан је са пролиферацијом, инвазијом и метастазама (25-27). Да бисмо боље разумели извор МНА у Т ћелијама код ТМЕ, користили смо scRNA-seq да бисмо окарактерисали експресију ННМТ у различитим типовима ћелија у асцитесу и туморима три пацијента са ХГСЦ (Табела С5). Анализа приближно 6.500 ћелија показала је да је у асцитесу и туморском окружењу експресија ННМТ била ограничена на претпостављене популације фибробласта и туморских ћелија (Слика 3, Ц и Д). Вреди напоменути да не постоји очигледна експресија ННМТ ни у једној популацији која експресује ПТПРЦ (ЦД45+) (Слика 3Д и Слика С5А), што указује да је МНА детектована у спектру метаболита уведена у Т ћелије. Експресија алдехид оксидазе 1 (AOX1) претвара MNA у 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2-PYR) или 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4-PYR); слика 3Б) је такође ограничена на популацију фибробласта који експресују COL1A1 (слика S5A), што заједно указује на то да Т ћелије немају способност конвенционалног метаболизма MNA. Образац експресије ових гена повезаних са MNA је верификован коришћењем другог независног скупа података о ћелијама из асцитеса пацијената са HGSC (слика S5B; n = 6) (16). Поред тога, квантитативна анализа полимеразне ланчане реакције (qPCR) здравих донорских Т ћелија третираних са MNA показала је да, у поређењу са контролним ћелијама тумора јајника SK-OV-3, NNMT или AOX1 готово нису били експресовани (слика 3Е). Ови неочекивани резултати указују на то да се MNA може излучивати из фибробласта или тумора у суседне Т ћелије код TME.
Иако кандидати укључују породицу органских катјонских транспортера 1 до 3 (OCT1, OCT2 и OCT3) кодираних породицом растворљивих носача 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 и SLC22A3), потенцијални транспортери MNA још увек нису дефинисани (28). QPCR mRNA из здравих донорских Т ћелија показао је ниске нивое експресије SLC22A1, али недетектабилне нивое SLC22A2, што је потврдило да је то раније објављено у литератури (Слика 3F) (29). Насупрот томе, ћелијска линија тумора јајника SK-OV-3 експресовала је високе нивое оба транспортера (Слика 3F).
Да би се тестирала могућност да Т ћелије имају способност да апсорбују страни MNA, здраве донорске Т ћелије су култивисане 72 сата у присуству различитих концентрација MNA. У одсуству егзогеног MNA, ћелијски садржај MNA се не може детектовати (Слика 3G). Међутим, активиране Т ћелије третиране егзогеним MNA показале су повећање садржаја MNA у ћелијама зависно од дозе, до 6 mM MNA (Слика 3G). Овај резултат указује да упркос ниском нивоу експресије транспортера и недостатку главног ензима одговорног за интрацелуларни метаболизам MNA, TIL и даље може да апсорбује MNA.
Спектар метаболита у Т ћелијама пацијената и експерименти апсорпције MNA in vitro повећавају могућност да фибробласти повезани са раком (CAF) луче MNA и да туморске ћелије могу регулисати фенотип и функцију TIL-а. Да би се утврдио ефекат MNA на Т ћелије, здраве донорске Т ћелије су активиране in vitro у присуству или одсуству MNA, а њихова пролиферација и производња цитокина су процењене. Након 7 дана додавања MNA у највећој дози, број удвостручења популације је умерено смањен, док је вигор одржан у свим дозама (Слика 4А). Поред тога, третман егзогеним MNA је резултирао повећањем удела CD4+ и CD8+ Т ћелија које експримирају фактор некрозе тумора-α (TNFα; Слика 4Б). Насупрот томе, интрацелуларна производња IFN-γ је значајно смањена у CD4+ Т ћелијама, али не и у CD8+ Т ћелијама, и није било значајне промене у интерлеукину 2 (IL-2; Слика 4, C и D). Стога је ензимски имуносорбентни тест (ELISA) супернатаната из ових култура Т ћелија третираних MNA показао значајно повећање TNFα, смањење IFN-γ и никакву промену IL-2 (Слика 4, од Е до Г). Смањење IFN-γ указује да MNA може играти улогу у инхибирању антитуморске активности Т ћелија. Да би се симулирао ефекат MNA на цитотоксичност посредовану Т ћелијама, химерне ћелије антигенског рецептора Т (FRα-CAR-T) које циљају фолни рецептор α и CAR-T (GFP) регулисане зеленим флуоресцентним протеином (GFP) -CAR-T) ћелије производе се од стране здравих мононуклеарних ћелија периферне крви (PBMC) донора. CAR-T ћелије су култивисане 24 сата у присуству MNA, а затим су кокултивисане са људским SK-OV-3 ћелијама тумора јајника које експримирају фолни рецептор α у односу ефектора и циља од 10:1. Третман MNA је резултирао значајним смањењем активности убијања FRα-CAR-T ћелија, што је било слично FRα-CAR-T ћелијама третираним аденозином (Слика 4H).
(А) Укупан број одрживих ћелија и удвостручавање популације (PD) директно из културе 7. дана. Стубичасти графикон представља средњу вредност + SEM шест здравих донора. Представља податке из најмање n = 3 независна експеримента. (Б до Д) CD3/CD28 и IL-2 су коришћени за активирање Т ћелија при њиховим одговарајућим концентрацијама MNA током 7 дана. Пре анализе, ћелије су стимулисане са PMA/јономицином са GolgiStop-ом током 4 сата. Експресија TNFα (Б) у Т ћелијама. Пример слике (лево) и табеларни подаци (десно) експресије TNFα у живим ћелијама. Експресија IFN-γ (Ц) и IL-2 (Д) у Т ћелијама. Експресија цитокина је мерена проточном цитометријом. Стубичасти графикон представља средњу вредност (н = 6 здравих донора) + SEM. Користите једносмерну анализу варијансе и поновљена мерења (*P<0,05 и **P<0,01) да бисте одредили P вредност. Представља податке из најмање n = 3 независна експеримента. (Е до Г) CD3/CD28 и IL-2 су коришћени за активирање Т ћелија при њиховим одговарајућим концентрацијама MNA током 7 дана. Медијум је сакупљен пре и после 4 сата стимулације PMA/јономицином. Концентрације TNFα (Е), IFN-γ (Ф) и IL-2 (Г) су мерене ELISA тестом. Стубичасти графикон представља средњу вредност (n = 5 здравих донора) + SEM. P вредност је одређена једносмерном анализом варијансе и поновљеним мерењима (*P<0,05). Испрекидана линија означава границу детекције. (Х) Тест ћелијске лизе. FRα-CAR-T или GFP-CAR-T ћелије су подешене аденозином (250μM) или MNA (10 mM) током 24 сата, или су остављене нетретиране (Ctrl). Проценат убијања SK-OV-3 ћелија је измерен. P вредност је одређена Welch t тестом (*P<0,5 и **P<0,01).
Да би се стекло механистичко разумевање регулације експресије TNFα зависне од MNA, процењене су промене у TNFα mRNA Т ћелија третираних MNA (Слика 5А). Здраве донорске Т ћелије третиране са MNA показале су двоструко повећање нивоа транскрипције TNFα, што указује да је MNA зависна од транскрипционе регулације TNFα. Да би се истражио овај могући регулаторни механизам, процењена су два позната транскрипциона фактора који регулишу TNFα, наиме активирани нуклеарни фактор Т ћелија (NFAT) и специфични протеин 1 (Sp1), као одговор на везивање MNA за проксимални TNFα промотор (30). TNFα промотор садржи 6 идентификованих места везивања NFAT и 2 места везивања Sp1, која се преклапају на једном месту [-55 базних парова (bp) од 5' капе] (30). Имунопреципитација хроматина (ChIP) показала је да се, када се третира са MNA, везивање Sp1 за TNFα промотор повећало три пута. Уградња NFAT-а се такође повећала и приближила се значају (Слика 5Б). Ови подаци указују да MNA регулише експресију TNFα путем Sp1 транскрипције, а у мањој мери и експресију NFAT-а.
(А) У поређењу са Т ћелијама култивисаним без MNA, промена експресије TNFα у Т ћелијама третираним са MNA је увећана. Приказан је образац експресије помоћу SEM (n = 5 здравих донора). Представља податке из најмање n = 3 независна експеримента. (Б) TNFα промотор Т ћелија третираних са или без 8 mM MNA након што су NFAT и Sp1 комбиновани са (Ctrl) и PMA/јономицинском стимулацијом током 4 сата. Имуноглобулин G (IgG) и H3 су коришћени као негативне и позитивне контроле за имунопреципитацију, респективно. Квантификација ChIP је показала да се везивање Sp1 и NFAT за TNFα промотор у ћелијама третираним MNA повећало неколико пута у поређењу са контролом. Представља податке из најмање n = 3 независна експеримента. P вредност одређена вишеструким t-тестовима (*** P <0,01). (Ц) У поређењу са асцитесом HGSC, Т ћелије (нецитотоксичне) су показале повећану експресију TNF у тумору. Боје представљају различите пацијенте. Приказане ћелије су насумично узорковане на 300 и подрхтаване да би се ограничило прецртавање (** Padj = 0,0076). (D) Предложени модел MNA за рак јајника. MNA се производи у туморским ћелијама и фибробластима у TME и апсорбују је Т ћелије. MNA повећава везивање Sp1 за TNFα промотор, што доводи до повећане TNFα транскрипције и TNFα цитокина. MNA такође узрокује смањење IFN-γ. Инхибиција функције Т ћелија доводи до смањене способности убијања и убрзаног раста тумора.
Према извештајима, TNFα има предње и задње зависне антитуморске и антитуморске ефекте, али има добро познату улогу у подстицању раста и метастаза рака јајника (31-33). Према извештајима, концентрација TNFα у асцитесу и туморским ткивима код пацијената са раком јајника је већа него у бенигним ткивима (34-36). Што се тиче механизма, TNFα може регулисати активацију, функцију и пролиферацију белих крвних зрнаца и променити фенотип ћелија рака (37, 38). У складу са овим налазима, анализа диференцијалне експресије гена показала је да је TNF значајно повећан у Т ћелијама у туморским ткивима у поређењу са асцитесом (Слика 5C). Повећање експресије TNF било је евидентно само у популацијама Т ћелија са нецитотоксичним фенотипом (Слика S5A). Укратко, ови подаци подржавају став да MNA има двоструке имуносупресивне и тумор-промотивне ефекте код HGSC.
Флуоресцентно обележавање засновано на проточној цитометрији постало је главна метода за проучавање метаболизма ТИЛ-а. Ове студије су показале да, у поређењу са лимфоцитима периферне крви или Т ћелијама из секундарних лимфоидних органа, мишји и људски ТИЛ имају већу тенденцију ка апсорпцији глукозе (4, 39) и постепеном губитку митохондријалне функције (19, 40). Иако смо у овој студији приметили сличне резултате, кључни развој је упоређивање метаболизма туморских ћелија и ТИЛ-а из истог ресетованог туморског ткива. У складу са неким од ових претходних извештаја, туморске (CD45-EpCAM+) ћелије из асцитеса и тумора имају већу апсорпцију глукозе него CD8+ и CD4+ Т ћелије, што потврђује да се висока апсорпција глукозе туморских ћелија може упоредити са Т ћелијама. Концепт конкуренције Т ћелија. ТМЕ. Међутим, митохондријална активност туморских ћелија је већа од активности CD8+ Т ћелија, али је митохондријална активност слична активности CD4+ Т ћелија. Ови резултати појачавају нову тему да је оксидативни метаболизам важан за туморске ћелије (41, 42). Такође сугеришу да CD8+ Т ћелије могу бити подложније оксидативној дисфункцији од CD4+ Т ћелија, или да CD4+ Т ћелије могу користити изворе угљеника осим глукозе да би одржале митохондријалну активност (43, 44). Треба напоменути да нисмо приметили никакву разлику у уносу глукозе или митохондријалној активности између CD4+ Т ефектора, Т ефекторских меморијских и Т централних меморијских ћелија у асцитесу. Слично томе, стање диференцијације CD8+ Т ћелија у туморима нема никакве везе са променама у уносу глукозе, што истиче значајну разлику између Т ћелија култивисаних in vitro и људских TIL in vivo (22). Ова запажања су такође потврђена употребом непристрасне аутоматске алокације ћелијске популације, што је додатно открило да су CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ ћелије са већим уносом глукозе и митохондријалном активношћу од туморских ћелија преовлађујуће, али имају метаболички активну ћелијску популацију. Ова популација може представљати претпостављену субпопулацију мијелоидних супресорских ћелија или плазмацитоидних дендритичних ћелија идентификованих у scRNA-seq анализи. Иако су оба ова појава пријављена код тумора јајника код људи [45], и даље је потребно даље истраживање како би се описала ова мијелоидна субпопулација.
Иако методе засноване на проточној цитометрији могу разјаснити опште разлике у метаболизму глукозе и оксидативном метаболизму између типова ћелија, прецизни метаболити које производи глукоза или други извори угљеника за митохондријални метаболизам у ТМЕ још увек нису одређени. Додељивање присуства или одсуства метаболита датом подскупу ТИЛ-а захтева пречишћавање ћелијске популације из исеченог ткива. Стога, наша метода обогаћивања ћелија у комбинацији са масеном спектрометријом може пружити увид у метаболите који су различито обогаћени у Т ћелијама и популацијама туморских ћелија у одговарајућим узорцима пацијената. Иако ова метода има предности у односу на сортирање ћелија активирано флуоресценцијом, одређене библиотеке метаболита могу бити погођене због инхерентне стабилности и/или брзе стопе обрта (22). Ипак, наша метода је била у стању да идентификује два препозната имуносупресивна метаболита, аденозин и кинуренин, јер се они значајно разликују између типова узорака.
Наша метабономска анализа тумора и TIL подтипова пружа више увида у улогу метаболита у TME јајника. Прво, коришћењем проточне цитометрије, утврдили смо да нема разлике у митохондријалној активности између тумора и CD4+ T ћелија. Међутим, LC-MS/MS анализа је открила значајне промене у обиљу метаболита међу овим популацијама, што указује да закључци о метаболизму TIL и његовој укупној метаболичкој активности захтевају пажљиво тумачење. Друго, MNA је метаболит са највећом разликом између CD45-ћелија и T ћелија у асцитесу, а не у туморима. Стога, компартментализација и локација тумора могу имати различите ефекте на метаболизам TIL, што истиче могућу хетерогеност у датом микроокружењу. Треће, експресија ензима NNMT који производи MNA је углавном ограничена на CAF, што је у мањој мери туморско, али се детектабилни нивои MNA примећују у T ћелијама изведеним из тумора. Прекомерна експресија NNMT у CAF јајника има познати ефекат подстицања рака, делимично због промоције метаболизма CAF, инвазије тумора и метастаза (27). Иако је укупни ниво TIL умерен, експресија NNMT у CAF је уско повезана са мезенхималним подтипом Атласа генома рака (TCGA), који је повезан са лошом прогнозом (27, 46, 47). Коначно, експресија ензима AOX1 одговорног за разградњу MNA је такође ограничена на CAF популацију, што указује да Т ћелије немају способност да метаболизују MNA. Ови резултати подржавају идеју да, иако је потребно даље истраживање да би се потврдио овај налаз, високи нивои MNA у Т ћелијама могу указивати на присуство имуносупресивног CAF микроокружења.
С обзиром на низак ниво експресије MNA транспортера и недетектабилне нивое кључних протеина укључених у метаболизам MNA, присуство MNA у Т ћелијама је неочекивано. Ни NNMT ни AOX1 нису могли бити детектовани scRNA-seq анализом и циљаном qPCR две независне кохорте. Ови резултати указују на то да MNA не синтетишу Т ћелије, већ се апсорбује из околног TME. In vitro експерименти показују да Т ћелије имају тенденцију да акумулирају егзогени MNA.
Наше in vitro студије су показале да егзогени MNA индукује експресију TNFα у Т ћелијама и појачава везивање Sp1 за TNFα промотор. Иако TNFα има и антитуморске и антитуморске функције, код рака јајника, TNFα може подстаћи раст рака јајника (31-33). Неутрализација TNFα у култури ћелија тумора јајника или елиминација TNFα сигнала код мишјих модела може побољшати производњу инфламаторних цитокина посредовану TNFα и инхибирати раст тумора (32, 35). Стога, у овом случају, MNA изведен из TME може деловати као проинфламаторни метаболит путем TNFα-зависног механизма кроз аутокрину петљу, чиме подстиче појаву и ширење рака јајника (31). На основу ове могућности, блокада TNFα се проучава као потенцијално терапијско средство за рак јајника (37, 48, 49). Поред тога, MNA смањује цитотоксичност CAR-T ћелија на ћелије тумора јајника, пружајући додатне доказе за MNA-посредовану имуносупресију. Заједно, ови резултати сугеришу модел у којем тумори и CAF ћелије луче MNA у екстрацелуларни TME. Кроз (i) стимулацију раста рака јајника изазване TNF-ом и (ii) инхибицију цитотоксичне активности Т ћелија изазване MNA-ом, ово може имати двоструки туморски ефекат (слика 5D).
Закључно, применом комбинације брзог обогаћивања ћелија, секвенцирања појединачних ћелија и метаболичког профилисања, ова студија је открила огромне имунометаболомичке разлике између туморских и асцитних ћелија код пацијената са ХГСЦ. Ова свеобухватна анализа је показала да постоје разлике у апсорпцији глукозе и митохондријалној активности између Т ћелија и идентификовала је МНА као нећелијски аутономни имунорегулаторни метаболит. Ови подаци утичу на то како ТМЕ утиче на метаболизам Т ћелија код људских карцинома. Иако је пријављена директна конкуренција за хранљиве материје између Т ћелија и ћелија рака, метаболити такође могу деловати као индиректни регулатори како би подстакли прогресију тумора и могуће сузбили ендогене имуне одговоре. Даљи опис функционалне улоге ових регулаторних метаболита може отворити алтернативне стратегије за побољшање антитуморског имуног одговора.
Узорци пацијената и клинички подаци су добијени путем спремишта ткива тумора рака Британске Колумбије које је сертификовала Канадска мрежа спремишта ткива. Према протоколу који су одобрили Етички комитет за истраживање рака Британске Колумбије и Универзитет Британске Колумбије (H07-00463), сви узорци и клинички подаци пацијената су добили информисани писани пристанак или су формално одустали од свог пристанка. Узорци се чувају у сертификованој Биобанци (BRC-00290). Детаљне карактеристике пацијената су приказане у табелама S1 и S5. За криопрезервацију, скалпел се користи за механичко разлагање узорка тумора пацијента, а затим се пропушта кроз филтер од 100 микрона да би се добила суспензија једне ћелије. Асцит пацијента је центрифугиран на 1500 о/мин током 10 минута на 4°C да би се ћелије пелетирале и уклонио супернатант. Ћелије добијене из тумора и асцитеса су криопрезервиране у 50% топлотно инактивираном хуманом AB серуму (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) и 10% диметил сулфоксиду. Ове конзервиране суспензије појединачних ћелија су одмрзнуте и коришћене за метаболомику и одређивање метаболита описано у наставку.
Комплетан медијум се састоји од 0,22 μm филтрираног 50:50 допуњеног RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-глутамина (Thermo Fisher Scientific) допуњеног са 10% топлотно инактивираног хуманог AB серума (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-глутамина (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x раствор пеницилин стрептомицина (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) и 50 μMB-меркаптоетанола. AimV (Invitrogen) је допуњен са 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) и 2 mM l-глутамина (Thermo Fisher Scientific). Пуфер за бојење проточног цитометра састојао се од 0,22 μm филтрираног фосфатно пуферованог физиолошког раствора (PBS; Invitrogen) допуњеног са 3% топлотно инактивираног AB хуманог серума (Sigma). Пуфер за обогаћивање ћелија састоји се од 0,22 μm филтрираног PBS-а и допуњеног са 0,5% топлотно инактивираног хуманог AB серума (Sigma-Aldrich).
У комплетном медијуму на 37°C, ћелије су обојене са 10 nM MT DR и 100 μM 2-NBDG током 30 минута. Затим, ћелије су обојене бојом за одрживост eF506 на 4°C током 15 минута. Ресуспендовати ћелије у FC Block (eBioscience) и Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), разблажити у пуферу за бојење проточног цитометра (према упутствима произвођача) и инкубирати 10 минута на собној температури. Обојити ћелије сетом антитела (Табела S2) у пуферу за бојење проточног цитометра на 4°C током 20 минута. Ресуспендовати ћелије у пуферу за бојење проточног цитометра (Cytek Aurora; конфигурација 3L-16V-14B-8R) пре анализе. Користите SpectroFlo и FlowJo V10 за анализу података о броју ћелија и користите GraphPad Prism 8 за креирање података. Медијални интензитет флуоресценције (MFI) 2-NBDG и MT DR је логаритамски нормализован, а затим је коришћен упарени t-тест за статистичку анализу како би се узели у обзир упарени пацијенти. Уклоните све популације са мање од 40 догађаја из анализе; унесите MFI вредност од 1 за све негативне вредности пре него што извршите статистичку анализу и визуелизацију података.
Да бисмо допунили стратегију ручног гејтинга горе наведеног процесног панела, користили смо пуну анотацију помоћу стабла рестрикције облика (FAUST) (21) да бисмо аутоматски доделили ћелије популацији након елиминисања мртвих ћелија у FlowJo-у. Ручно управљамо излазом како бисмо спојили популације које изгледају погрешно распоређене (комбиновање PD1+ са PD1-туморским ћелијама) и задржане популације. Сваки узорак садржи у просеку више од 2% ћелија, за укупно 11 популација.
Центрифугирање градијентом густине Фикола коришћено је за одвајање ПБМЦ од производа сепарације леукоцита (STEMCELL Technologies). CD8+ Т ћелије су изоловане из ПБМЦ коришћењем CD8 MicroBeads (Miltenyi) и експандиране у комплетном медијуму коришћењем TransAct (Miltenyi) током 2 недеље према упутствима произвођача. Ћелије су остављене да стоје 5 дана у комплетном медијуму који садржи IL-7 (10 нг/мл; PeproTech), а затим су поново стимулисане са TransAct. 7. дана, према упутствима произвођача, људске CD45 MicroBeads (Miltenyi) су коришћене за обогаћивање ћелија у три узастопна круга. Ћелије су аликвотиране за анализу проточне цитометрије (као што је горе описано), а милион ћелија је аликвотирано три пута за LC-MS/MS анализу. Узорци су обрађени LC-MS/MS као што је описано у наставку. Проценили смо вредност недостајућег метаболита са јонским бројем од 1.000. Сваки узорак је нормализован укупним бројем јона (TIC), логаритамски конвертован и аутоматски нормализован у MetaboAnalystR-у пре анализе.
Суспензија појединачних ћелија сваког пацијента је одмрзнута и филтрирана кроз филтер од 40 μм у комплетан медијум (као што је горе описано). Према протоколу произвођача, три узастопна круга позитивне селекције магнетним раздвајањем перлица коришћењем MicroBeads (Miltenyi) су коришћена за обогаћивање узорака за CD8+, CD4+ и CD45- ћелије (на леду). Укратко, ћелије су ресуспендоване у пуферу за обогаћивање ћелија (као што је горе описано) и пребројане. Ћелије су инкубиране са људским CD8 перлицама, људским CD4 перлицама или људским CD45 перлицама (Miltenyi) на 4°C током 15 минута, а затим испране пуфером за обогаћивање ћелија. Узорак се пропушта кроз LS колону (Miltenyi), а позитивне и негативне фракције се сакупљају. Да би се смањило трајање и максимизирао корак опоравка ћелија, CD8-фракција се затим користи за други круг CD4+ обогаћивања, а CD4-фракција се користи за накнадно CD45-обогаћивање. Раствор држати на леду током целог процеса раздвајања.
Да би се припремили узорци за анализу метаболита, ћелије су једном испране ледено хладним раствором соли, а сваком узорку је додато 1 мл 80% метанола, затим су вортексоване и брзо замрзнуте у течном азоту. Узорци су подвргнути три циклуса замрзавања-одмрзавања и центрифугирани на 14.000 о/мин током 15 минута на 4°C. Супернатант који садржи метаболите је испарен док се не осуши. Метаболити су поново растворени у 50 μl 0,03% мравље киселине, вортексовани да би се помешали, а затим центрифугирани да би се уклонили остаци.
Екстраховати метаболите као што је горе описано. Пребацити супернатант у боцу за течну хроматографију високих перформанси за метаболомичка истраживања. Користити протокол случајног третмана за третирање сваког узорка са сличним бројем ћелија како би се спречили ефекти шарже. Извршили смо квалитативну процену глобалних метаболита претходно објављену на AB SCIEX QTRAP 5500 троструком квадруполном масеном спектрометру (50). Хроматографска анализа и интеграција површине пика су извршене коришћењем софтвера MultiQuant верзије 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Број јона од 1000 је коришћен за процену вредности недостајућег метаболита, а TIC сваког узорка је коришћен за израчунавање нормализоване површине пика сваког детектованог метаболита како би се кориговале промене уведене инструменталном анализом из обраде узорка. Након нормализације TIC-а, MetaboAnalystR(51) (подразумевани параметар) се користи за логаритамску конверзију и аутоматско скалирање нормалне линије. Користили смо PCA са vegan R пакетом да бисмо извршили истраживачку анализу разлика у метаболому између типова узорака и користили смо анализу делимичне редундантности за анализу пацијената. Користили смо Ward метод за конструисање дендрограма топлотне мапе да бисмо груписали еуклидско растојање између узорака. Користили смо limma (52) на стандардизованом обиљу метаболита да бисмо идентификовали различито обилне метаболите у целом типу ћелија и микроокружењу. Да бисмо поједноставили објашњење, користимо параметар средње вредности групе да бисмо одредили модел и разматрали типове ћелија у микроокружењу као сваку групу (n = 6 група); за тест значајности, извршили смо три поновљена мерења за сваки метаболит. Да бисмо избегли лажну репликацију, пацијент је укључен као препрека у дизајну lima. Да бисмо проверили разлике у метаболитима између различитих пацијената, прилагодили смо лима модел укључујући пацијенте на фиксни начин. Извештавамо о значају унапред одређеног контраста између типа ћелија и микроокружења Padj <0,05 (Бенџамини-Хохбергова корекција).
Након обогаћивања енергетске снаге коришћењем Милтењи комплета за уклањање мртвих ћелија (>80% вијабилности), секвенцирање транскриптома појединачних ћелија је извршено на укупним живим замрзнутим узорцима асцитеса и тумора коришћењем протокола за експресију гена 10x 5′. Анализирано је пет случајева са подударним туморима и асцитесом, иако је ниска вијабилност једног узорка тумора спречила његово укључивање. Да бисмо постигли вишеструке селекције пацијената, комбиновали смо узорке сваког пацијента у тракама 10x хром контролера и анализирали асцитес и места тумора одвојено. Након секвенцирања [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; просечно 73.488 и 41.378 очитавања по ћелији за тумор и асцит, респективно]], користили смо CellSNP и Vireo (53) (засновано на CellSNP као... Уобичајеном људском SNP-у (VCF) који пружа GRCh38 додељен је идентитет донора. Користимо SNPRelate да закључимо најближи идентитет (IBS) статуса генотипа пацијента (IBS), искључујући недодељене ћелије и ћелије идентификоване као дуплекси и одговарајуће доноре између узорака асцитеса и тумора (54). На основу овог задатка, задржали смо три случаја са обилном заступљеношћу ћелија у тумору и асцитесу за анализу даљег тока. Након што смо извршили корак масовне филтрације у scater (55) и scran (56) BioConductor паковању, ово је дало 6975 ћелија (2792 и 4183 ћелије из тумора и асцитеса, респективно) за анализу. Користимо igraph-ово (57) Louvain кластеровање дељене мреже најближих суседа (SNN) на основу Jaccard удаљености до ћелија кластера експресијом. Кластери су ручно анотирани према претпостављеним типовима ћелија на основу експресије маркерских гена и визуализовани помоћу t-SNE. Цитотоксичне Т ћелије су дефинисане експресијом CD8A и GZMA, искључујући подкластере са ниском експресијом рибозомских протеина. Приступили смо објављеним подацима Изара и др. (16), укључујући њихово уграђивање t-SNE, који могу контролисати преклапање експресије између маркера имуних ћелија и експресије NNMT.
ПБМЦ су одвојене од производа сепарације леукоцита (STEMCELL Technologies) центрифугирањем са градијентом густине Фикол. CD3+ ћелије су изоловане из ПБМЦ коришћењем CD3 перли (Miltenyi). У присуству или одсуству MNA, CD3+ ћелије су активиране са CD3 везаним за плочу (5μг/мл), растворљивим CD28 (3μг/мл) и IL-2 (300 U/мл; Proleukin). Последњег дана експанзије, вијабилност (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) и пролиферација (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) су процењене проточном цитометријом. Процените ефекторску функцију стимулисањем ћелија са PMA (20 нг/мл) и јономицином (1 μг/мл) помоћу GolgiStop-а током 4 сата и пратите CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) и TNFα-флуоресцеин изотиоцијанат (FITC) (MAb11, BD). Стимулишите qPCR и ChIP ћелије са PMA (20 нг/мл) и јономицином (1 μг/мл) током 4 сата. ELISA супернатант је сакупљен пре и после стимулације са PMA (20 нг/мл) и јономицином (1 μг/мл) током 4 сата.
Пратите протокол произвођача за изолацију РНК користећи RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Користите QIAshredder (QIAGEN) за хомогенизацију узорка. Користите комплет за изолацију РНК високог капацитета у цДНК (Thermo Fisher Scientific) за синтезу комплементарне ДНК (цДНК). Користите TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) за квантификацију експресије гена (према протоколу произвођача) са следећим пробама: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [глицералдехид-3-фосфат ван водоника (GAPDH)] и Hs01010726_m1 (SLC22A2). Узорци су обрађени на StepOnePlus систему за ПЦР у реалном времену (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) у MicroAmp брзој оптичкој реакционој плочи са 96 бунарића (Applied Biosystems) са MicroAmp оптичким филмом. Било која Ct вредност која прелази 35 сматра се изнад прага детекције и означена је као недетектабилна.
Извршите ChIP као што је претходно описано (58). Укратко, ћелије су третиране формалдехидом (коначна концентрација 1,42%) и инкубиране на собној температури 10 минута. Користите допуњени пуфер за бубрење (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl и 0,1% NP-40) на леду 10 минута, а затим ресуспендујте у имунопреципитационом пуферу као што је описано (58). Узорак је затим сонициран са следећим циклусима: 10 циклуса (20 импулса од 1 секунде) и статичко време од 40 секунди. Инкубирајте ChIP имуноглобулин G (Cell Signaling Technology; 1μl), хистон H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) и SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) антитела са узорком на 4°C и мућкајте преко ноћи. Инкубирати протеинске А куглице (Thermo Fisher Scientific) са узорком на 4°C уз благо мућкање током 1 сата, затим користити chelex куглице (Bio-Rad) за обогаћивање ДНК и користити протеиназу К (Thermo Fisher) за варење протеина. TNFα промотор је детектован PCR-ом: напред, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; насупрот томе, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (продукт од 207 bp). Слике је направио Image Lab (Bio-Rad) и квантификоване помоћу ImageJ софтвера.
Супернатант ћелијске културе је сакупљен као што је горе описано. Одређивање је спроведено према процедурама произвођача за ELISA комплет за људски TNFα (Invitrogen), ELISA комплет за људски IL-2 (Invitrogen) и ELISA комплет за људски IFN-γ (Abcam). Према протоколу произвођача, супернатант је разблажен 1:100 за детекцију TNFα и IL-2, и 1:3 за детекцију IFN-γ. Користити EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) за мерење апсорбанције на 450 nm.
ПБМЦ су одвојене од производа сепарације леукоцита (STEMCELL Technologies) центрифугирањем са градијентом густине Фикол. CD3+ ћелије су изоловане из ПБМЦ коришћењем CD3 перли (Miltenyi). У присуству или одсуству MNA, CD3+ ћелије су активиране са CD3 везаним за плочу (5μг/мл), растворљивим CD28 (3μг/мл) и IL-2 (300 U/мл; Proleukin) током 3 дана. После 3 дана, ћелије су сакупљене и испране са 0,9% физиолошким раствором, а пелет је брзо замрзнут. Бројање ћелија је извршено проточном цитометријом (Cytek Aurora; конфигурација 3L-16V-14B-8R) коришћењем 123count eBeads.
Екстраховати метаболите као што је горе описано. Осушени екстракт је реконституисан у концентрацији од 4000 ћелијских еквивалената/μl. Анализирати узорак помоћу хроматографије са обрнутом фазом (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорнија) и CORTECS T3 колоне (2,1×150 mm, величина честица 1,6 μm, величина пора 120 Å; #186008500, Waters). Поларни масени спектрометар (6470, Agilent), у коме електроспреј јонизација ради у позитивном режиму. Мобилна фаза А је 0,1% мравља киселина (у H2O), мобилна фаза Б је 90% ацетонитрил, 0,1% мравља киселина. LC градијент је 0 до 2 минута за 100% А, 2 до 7,1 минута за 99% Б и 7,1 до 8 минута за 99% Б. Затим поново уравнотежите колону мобилном фазом А при брзини протока од 0,6 мл/мин током 3 минута. Брзина протока је 0,4 мл/мин, а комора колоне се загрева на 50°C. Користите MNA-ов стандард чистог хемијског осађивања (M320995, Toronto Research Chemical Company, Норт Јорк, Онтарио, Канада) да бисте утврдили време задржавања (RT) и трансформацију (RT = 0,882 минута, трансформација 1 = 137→94,1, трансформација 2 = 137→92, конверзија 3 = 137→78). Када се сва три прелаза догоде у тачном времену задржавања, прелаз 1 се користи за квантификацију како би се осигурала специфичност. Стандардна крива MNA (Toronto Research Chemical Company) је генерисана помоћу шест серијских разблажења основног раствора (1 mg/ml) да би се добили стандарди од 0,1, 1,0, 10 и 100 ng/ml и 1,0 и 10μg/ml респективно течности. Граница детекције је 1 ng/ml, а линеарни одговор је између 10 ng/ml и 10μg/ml. Свака ињекција од два микролитра узорка и стандарда користи се за LC/MS анализу, а мешовити узорак за контролу квалитета се врши сваких осам ињекција како би се осигурала стабилност платформе за анализу. MNA одговори свих ћелијских узорака третираних MNA били су унутар линеарног опсега теста. Анализа података је урађена коришћењем софтвера за квантитативну анализу MassHunter (v9.0, Agilent).
αFR-CAR конструкција друге генерације преузета је од Сонга и др. (59). Укратко, конструкција садржи следећи садржај: CD8a лидерску секвенцу, људски αFR-специфични варијабилни фрагмент једног ланца, CD8a шарнирни и трансмембрански регион, CD27 интрацелуларни домен и CD3z интрацелуларни домен. Комплетна CAR секвенца је синтетизована помоћу GenScript-а, а затим клонирана у лентивирусни експресиони вектор друге генерације узводно од GFP експресионе касете која се користи за процену ефикасности трансдукције.
Лентивирус се производи трансфекцијом ћелија HEK293T [Америчка колекција типових култура (ATCC); узгајаних у Дулбековом модификованом Игловом медијуму који садржи 10% феталног говеђег серума (FBS) и 1% PenStrep, а коришћен је CAR-GFP вектор и плазмиди за паковање (psPAX2 и pMD2.G, Addgene) користе липофекциони амин (Sigma-Aldrich). Супернатант који садржи вирус је сакупљен 48 и 72 сата након трансфекције, филтриран и концентрован ултрацентрифугирањем. Концентровани вирусни супернатант чувати на -80°C до трансдукције.
ПБМЦ се одвајају од производа за сепарацију леукоцита здравих донора (STEMCELL Technologies) центрифугирањем са градијентом густине Фикол. Користите микрокуглице позитивне селекције CD8 (Miltenyi) да бисте изоловали CD8+ ћелије из ПБМЦ. Стимулишите Т ћелије са TransAct (Miltenyi) и у TexMACS медијуму [Miltenyi; допуњен са 3% топлотно инактивираног људског серума, 1% PenStrep и IL-2 (300 U/ml)]. Двадесет четири сата након стимулације, Т ћелије су трансдуковане лентивирусом (10 μl концентрованог вирусног супернатанта на 106 ћелија). 1 до 3 дана након трансдукције на Cytek Aurora (на FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), процените GFP експресију ћелија да бисте показали ефикасност трансдукције од најмање 30%.
CAR-T ћелије су култивисане 24 сата у Immunocult-у (STEMCELL Technologies; допуњено са 1% PenStrep) под следећим условима: нетретиране, третиране са 250 μM аденозина или 10 mM MNA. Након претходне обраде, CAR-T ћелије су испране са PBS и комбиноване са 20.000 SK-OV-3 ћелија [ATCC; у McCoy 5A медијуму (Sigma-Aldrich) допуњеном са 10% FBS и 1% PenStrep-а на 10: Однос ефектора и циља од 1 је амплификован у три примерка у допуњеном Immunocult медијуму. SK-OV-3 ћелије и SK-OV-3 ћелије лизиране дигиталис сапонином (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) коришћене су као негативне и позитивне контроле, респективно. Након 24 сата кокултивације, супернатант је сакупљен и лактат дехидрогеназа (LDH) је мерена према упутствима произвођача (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH супернатант је разблажен 1:50 у LDH пуферу. Проценат убијања је мерен коришћењем следеће формуле: проценат убијања = проценат корекције / максимална стопа убијања x 100%, где је проценат корекције = само ко-култура-Т ћелије, а максимална стопа убијања = позитивна контрола-негативна контрола.
Као што је описано у тексту или материјалима и методама, користите GraphPad Prism 8, Microsoft Excel или R v3.6.0 за статистичку анализу. Ако се од истог пацијента прикупља више узорака (као што су асцит и тумор), користимо упарени t-тест или укључујемо пацијента као случајни ефекат у линеарни или генерализовани модел, према потреби. За метаболомичку анализу, тест важности се изводи у три примерка.
За додатне материјале за овај чланак, погледајте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ово је чланак отвореног приступа дистрибуиран под условима Creative Commons Attribution-Non-Commercial лиценце, која дозвољава употребу, дистрибуцију и репродукцију у било ком медијуму, све док коначна употреба није у комерцијалне сврхе и док је претпоставка да је оригинално дело исправно. Референца.
Напомена: Молимо вас да наведете своју адресу е-поште само да би особа коју препоручујете страници знала да желите да види имејл и да то није спам. Нећемо бележити никакве адресе е-поште.
Ово питање се користи да се провери да ли сте посетилац и спречи аутоматско слање спама.
Мариса К. Килгоур (Мариса К. Килгоур), Сарах МацПхерсон (Сарах МацПхерсон), Лаурен Г. Зацхариас (Лаурен Г. Зацхариас), Абигаил Ели Арис Г. Ватсон (Х. Ватсон), Јохн Стагг (Јохн Стагг), Бред Х. Нелсон (Брад Х. Беллини Ј. Р. Нелсон), Ралпх Ј. Р. ДеБерардинис), Расел Г. Џонс (Русселл Г. Јонес), Финес Т. Хамилтон (Пхинеас Т.
МНА доприноси имуносупресији Т ћелија и представља потенцијалну мету имунотерапије за лечење рака код људи.
Мариса К. Килгоур (Мариса К. Килгоур), Сарах МацПхерсон (Сарах МацПхерсон), Лаурен Г. Зацхариас (Лаурен Г. Зацхариас), Абигаил Ели Арис Г. Ватсон (Х. Ватсон), Јохн Стагг (Јохн Стагг), Бред Х. Нелсон (Брад Х. Беллини Ј. Р. Нелсон), Ралпх Ј. Р. ДеБерардинис), Расел Г. Џонс (Русселл Г. Јонес), Финес Т. Хамилтон (Пхинеас Т.
МНА доприноси имуносупресији Т ћелија и представља потенцијалну мету имунотерапије за лечење рака код људи.
©2021 Америчко удружење за унапређење науке. сва права задржана. АААС је партнер ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ЦХОРУС, ЦЛОЦКСС, ЦроссРеф и ЦОУНТЕР. СциенцеАдванцес ИССН 2375-2548.